| Project/Area Number |
20K07217
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48010:Anatomy-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
水谷 祐輔 北海道大学, 総合IR本部, 准教授 (40646238)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三上 剛和 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (80434075)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | イオンコンダクタンス顕微鏡 / 細胞質突起 / 機械学習 / 画像解析 |
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| Outline of Research at the Start |
走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）は，これまでの顕微鏡技法では困難だった無染色で生きた細胞の頂上膜面にある細胞質突起ダイナミクスの解析を可能にし，そのダイナミクスは細胞機能の一つである細胞運動と密接に関連していることが徐々に明らかになってきた。本研究では，SICMで取得される細胞膜表面の画像に対して構造判別評価システムを構築し，その手法に機械学習を用いる。これにより細胞質突起ダイナミクス評価を自動化し，細胞運動の性状が”通常状態”から”異常状態”へ遷移する過程における細胞の判別を行うことで細胞質突起ダイナミクスと細胞機能の関係性をさらに明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）を用いて取得できる生きた細胞の頂上膜面の細胞質突起の画像からダイナミクスを解析し、そのダイナミクスと細胞機能の関係性を解明することを目的としている。そのダイナミクスの解析には、本研究を通して構築する機械学習を用いたコンピュータ支援構造判別評価システムを使用し、画像判別を自動化することでより効率的におこなう事を並行して実施するものである。
取り組んでいる課題を以下に示した。
1. 画像データセットの収集と機械学習用データを用いたシステムの構築： 代表者が所有しているSICM像から継続的に画像データセットの収集および本研究に学習データとして用いるデータセットを選別し、システムの構築を進めている。構築においてはテスト画像データ等を処理させるなど適したものの選定をおこない、機械学習の作業環境整備を進め、識別アルゴリズムの性能向上を図っている。ただし、現時点では主に既存のSICM像の画像取得間隔が律速となり、有効な結果が得られていない。
2. 各細胞の細胞質突起の構造観察： SICMを用いた画像取得は、探針であるガラスピペットの形状や細胞の状態に依って適した画像取得に関するパラメータは異なる。本研究では、現状において適した画像取得パラメータを見出し、細胞質突起の観察はほぼ順調におこなえる状態である。
3. 可逆的形態変化のコントロール可能な細胞質突起構造をもつ細胞の探索： RAW264細胞をマクロファージ様細胞に分化誘導する実験モデルを検討し、本研究に適すると考える可逆的形態変化のコントロール可能な突起構造を有する条件を新たに見出した。さらに分化誘導条件が異なることで細胞の遺伝子発現パターンが異なることが明らかになり、それぞれ異なるマクロファージのサブタイプである可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
機械学習を用いた構造判別評価システムの構築に関しては、学習データ用に準備したSICM像のデータセットにより機械学習を実行し、細胞表面にある細胞質突起構造識別のアルゴリズムの作成を進展させているが、本年度は主に既存のSICM像の画像取得間隔が律速となっていることが分かり、有効な結果が得られていない。
また、本研究開始当初は、細胞質突起の性状が異なる状態およびその遷移過程の評価をおこなうためにTet On/Offシステムを用いてSLPIの発現を制御可能なCa9-22細胞の樹立を目指したが、樹立した細胞では当初期待していた顕著な細胞形態の変化は認められず、SLPI欠損による細胞形態変化が不可逆的効果であった場合には、SLPI発現の有無による細胞質突起変化の解析が困難になることから、代替となる様々な実験モデルの検討をおこなった。
代替実験モデル候補として、単球様のマウス由来RAW264をマクロファージ様細胞に分化誘導する実験モデルを検討し、その結果、球形のRAW264細胞をLPS（Lipopolysaccharide）や二本鎖 RNA のPoly(I:C)で刺激すると、数時間から24時間程度で、発達した細胞突起を有するマクロファージ様細胞に分化誘導することが可能であり、この実験モデルが本研究に適していることが分かった。
さらに本年度においてはLPS およびPoly(I:C)で刺激した細胞は各々遺伝子発現パターンが異なることが明らかになり、異なるマクロファージのサブタイプである可能性が示唆された。
これらを総合して、計画全体としては遅れての進捗となっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の本研究課題を進めていくために、研究に適していると判断したマウスマクロファージ由来Raw264細胞を用いて研究を進展させていく。LPS（Lipopolysaccharide）や二本鎖 RNA のPoly(I:C)による分化誘導を進め、本研究課題に適した培養条件によるSICMを用いた画像取得を進める。
LPS およびPoly(I:C)で刺激した細胞は各々遺伝子発現パターンが異なり、異なるマクロファージのサブタイプである可能性があり、近年はマクロファージの多様性が着目され、各疾患特異的なマクロファージも同定されている。そのことから、様々の疾患の予防、治療法開発の標的となっており、そのサブタイプの同定は重要な意味がある。
SICMによる細胞動態解析からこのサブタイプの識別が可能になれば、細胞診断等への応用が期待され、当初の予定になかった新規の展開であり、重要な課題として引き続き取り組む必要がある。
さらにシステム構築に関して既存のSICM像の画像取得間隔が律速となっているが、細胞表面にある細胞質突起構造識別のアルゴリズム作成を進展させるため、画像と答えが一緒になっている機械学習用データ（教師データ）を学習し，それらデータと似た新しいデータを生成させるといったGenerative Adversarial Network（GAN）などを用いることによって画像認識の方法の変更を検討する。
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