| Project/Area Number |
20K07489
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49050:Bacteriology-related
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| Research Institution | Osaka Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
牧 泰史 大阪医科薬科大学, 医学部, 講師 (60401733)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 秀司 大阪医科薬科大学, 医学部, 教授 (60288735)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 大腸菌 / 飢餓 / 定常期 / 寿命 / 遺伝子発現 / RNA / 細胞死 |
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| Outline of Research at the Start |
バクテリアは様々なストレスに耐える機構や、積極的に細胞死を引き起こすメカニズムを持つことが知られている。例えば定常期と呼ばれる栄養飢餓環境で大部分の細胞が死を選ぶ状況で、生き残る少数の細胞群が存在することで、全滅が避けられている。このようにクローン集団の中でシステムの発動に個体差が生じる理由は、まだ不明な点が多い。本研究は、飢餓ストレスにさらされた細胞の寿命に関わる遺伝子を探索し、これらの遺伝子の機能を調べることで、バクテリア細胞の生死選択メカニズムの解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
栄養源が枯渇した飢餓環境でのバクテリアの生存戦略としては、胞子形成や代謝抑制などが挙げられる。胞子形成能を持たないバクテリアの場合は、生育に不適な環境でも一部の細胞の生存を確保することが種の維持につながる。本研究は、このようなバクテリアのモデル生物として大腸菌を対象とし、その細胞集団内の個々の細胞が飢餓環境でどのように生死を選択するのか、そのメカニズムを探ることを目的としている。
これまでの研究から、大腸菌は飢餓環境下で一部の細胞を残して死ぬが、枯渇栄養源の種類によって飢餓環境下での生存率に違いが見られること、特定の栄養源の低下が長期に及ぶと細胞の生存率が低下し、そのとき細胞内RNAが減少していること、などが明らかとなった。RNAの大部分はrRNAであることを考えると、細胞内リボソームの分解が細胞の生死選択に関連している可能性があり、この原因を探ることは本研究の目的に沿う課題である。ある種の栄養源の枯渇でリボソームの分解が亢進することは、既に海外の研究者によって報告されているが、そのメカニズムは明らかとなっていない。そこで、過去にリボソームの分解に関与すると報告されている複数のRNaseについて、欠損株を用いた解析を行った。しかし、飢餓環境でのリボソーム分解の原因遺伝子の特定には至らず、これは継続課題となっている。一方で、培養環境のpHの微妙な変化が細胞の生存率に大きな影響を及ぼすことも明らかとなった。本年度は主にこの現象に着目し、培地組成やpHの違いと生存率の時間的な変化を追っている。長寿命細胞と短寿命細胞のRNA-seq比較解析によって生死選択メカニズムの解明を目指すことが本研究の最終的な目的であるため、これまで明らかにしたリボソームの分解状況や生存率の違いを見ながら、培養条件やサンプリングの時期について検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究は、飢餓ストレス下で寿命と相関が見られる遺伝子を探索し、その動態・機能解析によって、定常期の生死決定メカニズムが発動される要因の解明を目的とする。これまでの研究により、リボソームの分解が細胞の寿命に影響を及ぼしている可能性が示唆された。この現象のメカニズムを明らかにすることは本研究の目的に沿うため、遺伝子欠損株を用いて原因遺伝子を探索したが、現在までのところその解明には至っていない。一方で、これまでの研究で、培養条件のうちpHの微妙な変化も生存率に影響を与えることがわかった。現在は、この条件を変化させることで、細胞の寿命をある程度長期化または短期化させることが可能となっている。細胞が死を迎える直前の遺伝子発現状況をとらえることが、細胞死のメカニズム解明に重要と考えており、今はその解析のための培養条件やサンプリング時期の検討に入っている段階である。実際に細胞をサンプリングしてRNA-seq解析をおこなうことは、本年度末までには終了している予定であったため、進捗状況の区分は「やや遅れている」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究課題の基本的な部分は当初の研究計画に沿って推進する。特に、細胞死の直前の網羅的な遺伝子発現解析から、細胞死の選択メカニズムを明らかにする試みは、次年度に実施する計画であり、これまで行ってきた培養条件の検討等の実験結果を生かす予定である。またそれに関連して、飢餓ストレス下でのゲノム変異（GASP変異)についても次年度実施する予定である。
ただ、様々な研究費用の値上がりの影響は避けられないと考えている。具体的には、核酸調製キットや受託シーケンスサービスなどの価格・費用の上昇である。培養条件や培養期間を様々に変えて調製したRNAやゲノムについて、できるだけ多くのサンプルで比較解析をすることが、本研究の目的達成に重要であると考えていたが、当初計画よりも解析するサンプル数を削減する必要がありそうである。現在はその対策として、サンプル数を減らしつつも細胞死選択の特徴を捉えるための、効果的なサンプリング条件につて、検討に入っている。
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