| Project/Area Number |
20K07490
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49050:Bacteriology-related
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
山澤 龍治 摂南大学, 薬学部, 助教 (20624068)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
桑名 利津子 摂南大学, 薬学部, 講師 (50330361)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | システインプロテアーゼ / 芽胞 / zymogen / プロセッシング / プロテアーゼ / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Research at the Start |
芽胞形成菌は栄養飢餓状態になると栄養細胞形態から芽胞へと形態変化する。加熱等の対応は行われているが、芽胞は耐熱性が高く、常在菌であることから食品混入は完全に防ぐことはできない。食品製造業会において、食の安全性・信頼性の面から芽胞への対処は強く望まれている。
YabG は2000年に芽胞形成に重要なタンパク質分解酵素であることが明らかにされたが、詳細な機能は未だに明らかになっていない。本研究課題は、YabGの詳細な機能を明らかにすることで、芽胞をターゲットとした抗菌薬、食品安定剤の開発に繋げることを目的としている。
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| Outline of Annual Research Achievements |
枯草菌YabGの組換え体YabGは芽胞形成菌に存在する34 kDaのタンパク質をコードする遺伝子で、芽胞殻に含まれる芽胞形成タンパク質をプロセシングするプロテアーゼであることが報告されている。既存のプロテアーゼとの相同性は低くMEROPSデータベースの分類はfamily U57（unknown catalytic type）で、触媒機構等は不明であった。
これまでに組換え体を用いてYabGがアルギニンのC末端側を加水分解するエンド型システインプロテアーゼであることを明らかにした。さらにSporopainがLys基質に対して活性が無い、Arg特異的であることを明らかにした。これはMEROPSデータベースに登録されている113種のシステインプロテアーゼのファミリーのいずれとも配列が一致しない、新規のシステインプロテアーゼであることを明らかにし、我々はYabGを「Sporopain」と命名した。Sporopainの活性中心付近の配列はClan CD に属する酵素群と配列が類似することから、Sporopain はClan CDに属すると考えられる。Sporopainは全長35 kDaで発現したあと、自己分解することで、一旦24-kDa 中間体になり、その後、数 kDa に自己分解する。35 kDa全長体から24 kDa中間体に自己分解する際には、5つの中間体があることがSDS-PAGEで確認できた。これらの中間体はN末シークエンス解析の結果より、YabGのN末端側のArg5、Arg17、Arg49、Arg93のC末端側が加水分解されていることを明らかにした（Yamazawa et al., 2021, Kuwana et al., 2022, Kuwana et al., 2023)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2021年度までの結果をJounal of biochemistryに掲載することができた（Yamazawa et al. J Biochem. 2022 Mar3;171(3):315-324.)。さらに、Clostridium属細菌、Geobacillus属細菌のsporopainのクローニング、組換えタンパク質の発現・精製・活性測定を行い、sporopainの基質特異性や、各細菌のsporopainの菌特異的機能を明らかにすることができた。現在、投稿論文を調整中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究で、SporopainがN末端領域をどの様に分解するかは明らかにしてきたが、その機能までは明らかにできていない。N末端の機能を明らかにするためにN末端領域によるSporopainのプロテアーゼ活性の影響を、組換え体を用いて検討して行く。また、申請書の研究実践計画にある様に結晶構造解析を進めて行く。
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