複製ストレス応答における癌抑制因子の新機能と染色体不安定化の抑制機構の解明

Research Project

Project/Area Number	20K07614
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 50010:Tumor biology-related
Research Institution	Hamamatsu University School of Medicine
Principal Investigator	内田千晴浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 准教授 (60223567)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	塩谷文章国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, ユニット長 (10627665) 丹伊田浩行浜松医科大学, 医学部, 准教授 (20336671) 北川雅敏浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	複製ストレス / ATR / がん抑制遺伝子 / DNA複製ストレス / RBファミリー
Outline of Research at the Start	細胞は、薬剤や紫外線などによって誘発されるDNA 複製障害=複製ストレスに応答し、異常な染色体構造の発生を回避するしくみを備えている。複製障害発生直後はATRというリン酸化酵素が活性化され、障害が除かれるまで細胞増殖を一時停止させる経路が働く。しかし障害が長時間続くとDNA の二本鎖切断:DSBが発生し、DSB が修復されない場合は別のリン酸化酵素ATMの経路が活性化され、細胞死をひきおこす。これらの複製ストレス応答経路のバランスは、染色体異常・不安定化を抑制し、がん化を防ぐために重要であると考えられている。本研究では、これらの経路の制御に関わると予想されるがん抑制遺伝子産物の機能を解明する。
Outline of Annual Research Achievements	DNA複製障害による複製フォーク進行の遅延・停止(複製ストレス)に対し、細胞応答の初期ではATR経路が活性し、複製障害が解消されるまで細胞周期を停止させる。しかし長時間の障害は、DNA二本鎖切断(DSB)発生-ATM経路を発動し、不完全な複製DNAをもつ細胞を排除する。これら二つの経路の制御は染色体安定性において極めて重要であるが、「ATR-ATM経路の切り替えの制御因子は何か、その機能の破綻は、がん化の要因である染色体不安定化にいかに結びつくか」は明らかではない。申請者らは、がん抑制遺伝子産物RBファミリーの一つであるp130RB2が、DNA複製阻害に対する初期応答（複製ストレス初期の応答）でのATR活性化に寄与することを見出した。令和4年度はp130RB2がATR活性化経路であるETAA1-RPA32に関与し、複製ストレスにおけるATR活性化を正に制御することを明らかにした。p130RB2とETAA1の相互作用は、免疫蛍光染色法およびPLA法による共局在画像解析や生化学的沈降実験によって証明した。さらに、p130RB2の機能喪失により、複製ストレスにおけるATR活性化の抑制、複製ストレス解消後の細胞周期進行の異常、anaphase染色体の異常、細胞生存率の低下が生じることがわかった。p130RB2の機能喪失による活性化メカニズムの破綻が、複製ストレス解消後の細胞の染色体異常や増殖異常を誘発することが示唆された。がん抑制遺伝子産物RBファミリーは、既知の細胞周期G1-S進行阻害機能に加え、S期複製阻害において重要な役割をもつという新たな知見を得られた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 令和４年度は、複製ストレス初期のATR活性化機構にフォーカスし、がん抑制遺伝子産物p130RB2がETAA1-RPA32経路を介してATR活性化において正に関与することを明らかにした。令和4年度はp130RB2がATR活性化経路であるETAA1-RPA32に関与し、複製ストレスにおけるATR活性化を正に制御することを明らかにした。p130RB2とETAA1の相互作用は、免疫蛍光染色法およびPLA法による共局在画像解析や生化学的沈降実験によって証明した。さらに、p130RB2の機能喪失により、複製ストレスにおけるATR活性化の抑制、複製ストレス解消後の細胞周期進行の異常、anaphase染色体の異常、細胞生存率の低下が生じることがわかった。p130RB2の機能喪失による活性化メカニズムの破綻が、複製ストレス解消後の細胞の染色体異常や増殖異常を誘発することが示唆された。ここまでの知見をまとめ、国際誌へ論文投稿を行い、リバイス実験を完了した。
Strategy for Future Research Activity	令和5年度は令和4年度までに得られた知見から発展させ、並行して見出していた新たな実験結果に着目し、他のATR活性化因子やATM活性化因子とがん抑制遺伝子産物との相互作用・機能相関について検証を進める。細胞周期制御因子の既存のメカニズムとの差異、新規性についてさらに詳細な解析を進める。また、他のRBファミリーが新規の細胞内機能を有するかついても検証を行う。