炎症性腸疾患における新規粘膜関連細菌叢検出法を用いた腸粘膜炎症プロファイルの作成

• Project/Area Number: 20K07801
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 52010:General internal medicine-related
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 中村 正直 名古屋大学, 医学部附属病院, 准教授 (60467321)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 本多 隆 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (10378052) ; 山村 健史 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (10709091) ; 川嶋 啓揮 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (20378045) ; 藤城 光弘 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (70396745)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: 潰瘍性大腸炎 / RNAシークエンス / 腸粘液 / 神経伝達因子 / クローン病 / 粘膜関連細菌叢 / フローサイトメトリー

Outline of Research at the Start

炎症性腸疾患の腸表面の粘膜関連細菌叢から粘膜固有層までの免疫増幅経路は同時に同部位で評価すべき事象である。同じ部位の内視鏡生検検体を用いて、A)粘膜関連細菌叢の最適検出法を見出したうえで採取、細菌16SrRNA次世代シークエンス解析を行う。B)生検組織のフローサイトメトリーによる免疫担当細胞とT細胞の分布解析、細胞内炎症性サイトカインの定量を行い、免疫応答をカテゴリー化する。C)粘膜内蛋白質量解析により、炎症反応のKeyとなる分子の量と種類につき網羅的に解析する。A)B)C)から得た結果を疾患活動性とリンクさせ、腸粘膜炎症プロファイルを作成する。

Outline of Annual Research Achievements

20名の潰瘍性大腸炎患者において大腸内視鏡時に回腸末端、盲腸、直腸の生検組織、腸粘液を採取した検体について、腸炎の活動性と各炎症マーカー、神経ー免疫系にかかわる測定項目について既報を基に研究分担者と選定中である。
追加で潰瘍性大腸炎患者3名の大腸内視鏡時における腸粘液をサンプルとし発症、再燃増悪に関連する因子の同定を目的とした。適切な検体採取の整合性を評価後、採取サンプル（炎症有無部位での比較）の網羅的解析を行った。独自の方法を用いて粘液層採取及びRNA抽出を行い、粘液層でのbulkのRNA seqを行った。ネットカテーテルによる粘液採取ではRNA抽出初期にネット自体が試薬内に溶け出し順調に進まなかったため、この実験は全てブラシ鉗子を用いて行った。腸粘液のRNAシークエンス実現性につき採取、抽出されたRNAの濃度、純度を測定しRNAシークエンスが可能と判断した。RNAシークエンスについてはraw dataから解析（QC, mapping, quantification, clustering, DE analysis, functional enrichment）を施行した際に神経伝達に関わる因子が複数指摘された。また我々の粘液層でのdata解析結果と、public dataの腸管上皮のRNA seqの解析結果を比較した。粘液層と腸管粘膜の網羅的解析結果を比較すると神経伝達に関連する因子が同定され、これらの因子が炎症に関与する可能性を考慮した。候補となった神経伝達因子については粘液内、粘膜内における存在をリアルタイムPCRで確認し、その各々が潰瘍性大腸炎の寛解期、活動期のいずれかで影響が大きいか調べた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

大腸内視鏡によるサンプル採取方法の調整については、既報が無かったため時間を要し、更に測定項目の選定に時間を要したため全体の進行としてはやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

サンプル採取調整が終わり、現在はサンプル採取方法、実験系は確立できたため現在のペースで進めることができれば研究を完遂できると考えている。

Research Products

• [Journal Article] Preliminary Comparison of Endoscopic Brush and Net Catheters as the Sampling Tool to Analyze the Intestinal Mucus in the Rectum with Ulcerative Colitis Patients (2022)
  • Author(s): Nakamura M, Maeda K, Yamamoto K, Yamamura T, Sawada T, Ishikawa E, Kakushima N, Furukawa K, Iida T, Mizutani Y, Ishikawa T, Ohno E, Honda T, Ishigami M, Kawashima H.
  • Journal Title: Digestion Volume: 103 (3) Issue: 3 Pages: 232-243
  • DOI: 10.1159/000521929
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Gelsolin as a potential biomarker for endoscopic activity and mucosal healing in ulcerative colitis (2022)
  • Author(s): Keiko Maeda, Masanao Nakamura, Takeshi Yamamura, Tsunaki Sawada, Eri Ishikawa, Akina Oishi, Shuji Ikegami, Naomi Kakushima, Kazuhiro Furukawa, Tadashi Iida, Yasuyuki Mizutani, Takuya Ishikawa, Eizaburo Ohno, Takashi Honda, Masatoshi Ishigami and Hiroki Kawashima
  • Journal Title: Biomedicines Volume: -
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Microbiome, fibrosis and tumor networks in a non-alcoholic steatohepatitis model of a choline-deficient high-fat diet using diethylnitrosamine (2021)
  • Author(s): Yamamoto K, Honda T, Yokoyama Y, Ma L, Kato A, Ito T, Ishizu Y, Kuzuya T, Nakamura M, Kawashima H, Ishigami M, Tsuji M N, Fujishiro M.
  • Journal Title: Digestive and Liver Disease Volume: - Issue: 11 Pages: 00081-5
  • DOI: 10.1016/j.dld.2021.02.013
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The relationship between oral‐origin bacteria in the fecal microbiome and albumin?bilirubin grade in patients with hepatitis C (2020)
  • Author(s): Yamamoto Kenta、Honda Takashi、Ito Takanori、Ishizu Yoji、Kuzuya Teiji、Nakamura Masanao、Miyahara Ryoji、Kawashima Hiroki、Ishigami Masatoshi、Fujishiro Mitsuhiro
  • Journal Title: Journal of Gastroenterology and Hepatology Volume: 36 Issue: 3 Pages: 790-799
  • DOI: 10.1111/jgh.15206
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Endoscopic Activity and Serum TNF-α Level at Baseline Are Associated With Clinical Response to Ustekinumab in Crohn’s Disease Patients (2020)
  • Author(s): Murate Kentaro、Maeda Keiko、Nakamura Masanao、Sugiyama Daisuke、Wada Hirotaka、Yamamura Takeshi、Sawada Tsunaki、Mizutani Yasuyuki、Ishikawa Takuya、Furukawa Kazuhiro、Ohno Eizaburo、Honda Takashi、Kawashima Hiroki、Miyahara Ryoji、Ishigami Masatoshi、Nishikawa Hiroyoshi、Fujishiro Mitsuhiro
  • Journal Title: Inflammatory Bowel Diseases Volume: 26 Issue: 11 Pages: 1669-1681
  • DOI: 10.1093/ibd/izaa086
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Glycoproteomic analysis identifies cryptdin-related sequence 1 as O-glycosylated protein modified with α1,2-fucose in the small intestine (2020)
  • Author(s): Hashiguchi Hiroki、Tsukamoto Yohei、Ogawa Mitsutaka、Tashima Yuko、Takeuchi Hideyuki、Nakamura Masanao、Kawashima Hiroki、Fujishiro Mitsuhiro、Okajima Tetsuya
  • Journal Title: Archives of Biochemistry and Biophysics Volume: 695 Pages: 108653-108653
  • DOI: 10.1016/j.abb.2020.108653
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 大腸カプセル内視鏡を用いたクローン病全消化管観察の有用性 (2023)
  • Author(s): 山村健史、中村正直、澤田つな騎、川嶋啓揮
  • Organizer: 第16回日本カプセル内視鏡学会学術集会
• [Presentation] Gelsolinは潰瘍性大腸炎の内視鏡的活動性と粘膜治癒を反映するバイオマーカーとなる (2023)
  • Author(s): 前田啓子, 中村正直, 川嶋啓揮
  • Organizer: 第13回日本炎症性腸疾患学会学術集会
• [Presentation] 大腸カプセル内視鏡を用いたクローン病全消化管観察の試み (2021)
  • Author(s): 中村正直, 山村健史, 藤城光弘
  • Organizer: 第101回日本消化器内視鏡学会総会 シンポジウム
• [Presentation] クローン病の小腸狭窄に対するバルーン内視鏡下バルーン拡張術の治療成績 (2021)
  • Author(s): 池上脩二, 中村正直, 藤城光弘
  • Organizer: 第101回日本消化器内視鏡学会総会 パネルディスカッション
• [Presentation] 高齢者潰瘍性大腸炎治療指針の検証「当院における高齢発症潰瘍性大腸炎の臨床的特徴」 (2021)
  • Author(s): 澤田つな騎,中村正直,山村健史,前田啓子,水谷泰之,石川恵里,藤城光弘
  • Organizer: 第17回日本消化管学会総会学術集会 ワークショップ16
• [Presentation] IBD診療におけるカプセル内視鏡「クローン病の予後予測因子とカプセル内視鏡Lewis scoreの臨床的意義の検討」 (2021)
  • Author(s): 梶川豪,中村正直,山村健史,前田啓子,澤田つな騎,水谷泰之,石川恵里,橋口裕樹,村手健太郎,喜田裕一,濵崎元伸,江﨑正哉,山田健太朗,長谷川一成.鳥山和浩,池上脩二,藤城光弘
  • Organizer: 第14回日本カプセル内視鏡学会学術集会 ワークショップ4
• [Presentation] 大腸カプセル内視鏡の普及に向けた工夫「大腸カプセル内視鏡によるクローン病診断への応用に向けて」 (2021)
  • Author(s): 中村正直,山村健史,前田啓子,澤田つな騎,水谷泰之,石川恵里,角嶋直美,古川和宏,藤城光弘
  • Organizer: 第14回日本カプセル内視鏡学会学術集会 パネルディスカッション5
• [Presentation] クローン病における小腸大腸粘膜関連細菌叢の検討 (2020)
  • Author(s): 服部峻,中村正直,藤城光弘
  • Organizer: 第106回日本消化器病学会総会 ワークショップ12