The development of method to activative immune tolerance involved in fertility

Research Project

Project/Area Number	20K07856
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 52010:General internal medicine-related
Research Institution	Tohoku Medical and Pharmaceutical University
Principal Investigator	小林匡子東北医科薬科大学, 薬学部, 講師 (50438561)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help	¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000) Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2022: ¥130,000 (Direct Cost: ¥100,000、Indirect Cost: ¥30,000) Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2020: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Keywords	免疫寛容 / 制御性T細胞 / CTLA-4 / IL-17 / 妊娠 / 黄耆建中湯 / 妊孕性 / オウギ / 漢方薬
Outline of Research at the Start	無理なダイエットなどによる月経不順や妊孕性の低下は、虚弱体質に陥ったことによる生体の恒常性の破綻が原因である。妊娠の維持には過剰な免疫応答を寛容（抑制）する事が重要であるが、我々は免疫寛容に導く制御性T細胞の増加作用が報告されている生薬オウギが、妊孕性を増加させることを見い出した。そこで本研究では、医療現場で虚弱体質の改善に使用されるオウギ配合漢方薬のうち、黄耆建中湯、帰耆建中湯、桂枝加黄耆湯、防己黄耆湯を投与した雌性マウスの子宮脱落膜において、妊娠の維持に寄与するCTLA4+ CD4+ CD25+制御性T細胞の増加が認められるか調査し、妊孕性改善への適用を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	6週令BALB/c雌性マウスに、オウギ又はオウギ配合漢方薬エキス（防己黄耆湯、帰耆建中湯、黄耆建中湯、桂枝加黄耆湯）の熱水抽出エキスをそれぞれ21日間給水瓶にて自由摂取させた後、自由摂取を解除して直ちにBALB/c雄性マウスと同居させた。同居日から体重が3.5g以上増加した（子宮脱落膜が形成された）雌性マウスをイソフルランにより安楽死させ、心臓血、脾臓、子宮を摘出し、さらに子宮中の胎児数をカウントした。血液及び子宮のリンパ球中のCD4+ CD25+ CTLA-4+ T細胞及びCD4+ IL-17A+ T細胞をフローサイトメトリーにより測定した。コントロール群と比較して、オウギ群の胎児数は増加傾向を示し、また、同群のCD4+ IL-17A+ T細胞数は減少傾向を示したが、有意な差は認められなかった。今後の本研究の展開として、エキスの投与経路、投与期間を変更し、エキスの経口投与を同居後3.5ｇ以上の体重増加が認められるまで継続する。さらに、フローサイトメトリーにおいて使用するT細胞マーカーの種類を変更及び増加し、制御性Ｔ細胞（Treg）に発現しているマーカーとしてCD4、CD25、Foxp3、IL-10を使用し、細胞障害性Ｔh17細胞（Th17）のマーカーとして、CD4、CD126、STAT3、IL17Aを使用してフローサイトメトリーを行い、Tregが関与する妊娠時の免疫寛容を促進するオウギ配合漢方薬を見出す。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本年度の研究では、21日間のエキス溶液の自由摂取を終了後、雄性マウスと同居させ、妊娠により3.5ｇ以上の体重増加を示した雌性マウスを安楽死させ、摘出した子宮から抽出したリンパ球に対しフローサイトメトリーを行った。しかし、この方法では、同居から交配に至るまでの日数がペアごとに大幅に異なり、エキスの影響下における交配が認められない場合もあった。結果として、個体差が大きくなり、オウギのみに細胞障害性T細胞の減少傾向が認められたものの、妊娠時の免疫寛容にオウギが影響したか不明瞭であった。そのため、エキスの投与経路、投与期間を変更し、再度試験を行う必要性があると考えられた。
Strategy for Future Research Activity	次年度はエキスの投与経路を経口投与に変更し、同居後も雌性マウスが子宮脱落膜形成に至るまでエキスを継続的に投与することによって、エキス影響下における妊娠時の免疫寛容に影響を与えるオウギ配合漢方薬を見出す。