Analysis of the regulation mechanism of CHK1 by Mule during myocardial stress response

Research Project

Project/Area Number	20K08410
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 53020:Cardiology-related
Research Institution	Kanazawa Medical University
Principal Investigator	竹田健史金沢医科大学, 総合医学研究所, 助教 (90340009)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000) Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	Mule / AGEs / CHK1 / 細胞内タンパク質品質管理 / タンパク分解 / Kmur
Outline of Research at the Start	Mule/HUWE1はHECT型E3リガーゼとして機能する約460kDaの巨大な分子である。心臓においてMuleは酸化ストレスに対して保護的に働き、心疾患を有する患者ではその発現レベルが有意に低下していることが近年報告されたが、Muleの心筋保護的な作用機構の詳細については不明な点が多い。本研究では、Muleの基質分子の一つとして知られ、DNA損傷チェックポイント機構に働くCHK1やその不活性化変異体が、Muleによってどのように認識・分解されるのかを明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	本年度はMuleやその基質における糖化ストレス応答を調べた。高血糖状態や条件下では、グルコース、グルコースの代謝中間体やその分解物などが細胞内蛋白質と非酵素的に結合して終末糖化産物（AGEs）が生成される。様々なAGEsのうち、フルクトースおよびグルコース代謝の中間体であるグリセルアルデヒド（GA）由来のAGEs (TAGE) は強い細胞毒性を示し、その細胞内蓄積は心筋細胞や心線維芽細胞を含め、様々な細胞死を誘導することが過去に報告されている。今回、GA投与によってCHK1凝集体の蓄積が観察され、CHK1がTAGE修飾の標的となり、その機能を喪失することが細胞死を誘導する一因である可能性が考えられた。一方、GA刺激によるCHK1変異体の分解には、Muleのノックダウンによる効果は認められず、凝集体形成も抑制しなかった。したがって、CHK1変異体の糖化刺激に依存した分解機構にはMuleは関与しないと考えられた。驚いたことに、MuleもGAによる糖化刺激の影響を大きく受けることが今回明らかとなった。GA投与によるMuleの減少が、その迅速な分解の結果であるのか、それとも糖化したMuleが高分子複合体を形成した結果、消失したように見えるのかは明らかにできなかった。その理由は、Muleが約460kDaという巨大な蛋白質であるために、Muleが糖化によって分子間架橋を形成し始めると、1000kDaを超えるサイズとなるため、通常のウェスタンブロット解析においては、このような高分子蛋白質のPVDFメンブレンへの転写効率が極端に低下してしまうためである。Muleのような巨大なユビキチンリガーゼには、糖化修飾のターゲットとなるリジンやアルギニン残基が豊富に存在するために、その修飾を受けやすいと考えられるが、MuleのGAによる糖化修飾の影響に関しては今後さらに詳細な解析が必要である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 遅れている大きな理由は、コロナ禍によりこれまで定期的に入手可能だった免疫沈降に優良な海外メーカー製の抗体の欠品や、タンパク吸着を抑えた表面加工を施したローバインディング仕様のフィルターチップなどの消耗品入荷の遅延である。特に、今回の免疫沈降実験の結果に大きく影響する特異性の高い抗V5タグ抗体ビーズが途中で納入未定となり、使用実績のない代替品への変更を余儀なくされたため、その後の抗体のクオリティーチェックや条件変更に予定外の時間がかかった。
Strategy for Future Research Activity	当初の予定から変更し、心筋細胞や肝細胞の細胞内で蓄積したAGEsが細胞死を誘導するという過去の複数の報告から、AGEsの中でも毒性の高いTAGE蓄積がMuleとその基質であるCHK1変異体に及ぼす影響を調べることとした。今回、GA投与により、CHK1変異体の迅速な分解が誘導され、同時にMuleの挙動も変化することがわかった。今後はそれらの経路に関わるシグナル伝達系を解析し、Muleの糖化修飾とCHK1変異体の迅速な分解に関わる細胞内経路を明らかにしていきたい。