| Project/Area Number |
20K09211
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55050:Anesthesiology-related
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| Research Institution | Kindai University (2022-2023)
Kansai Medical University (2020-2021) |
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Principal Investigator |
中嶋 康文 近畿大学, 医学部, 教授 (70326239)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹下 淳 関西医科大学, 医学部, 研究医員 (40433263)
影山 京子 関西医科大学, 医学部, 研究医員 (80347468)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2022: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | microRNA / 遺伝子治療 |
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| Outline of Research at the Start |
耐糖能障害を伴う（重症）敗血症では、過剰な免疫抑制状態が生じ、予後不良を来すが、我々は血球や血管内皮細胞が産生するmicroRNA（miRNA）が、炎症病態を修飾する重要な要因になると考える。その機序と新しい治療法を見出すために、次世代シーケンサーによる網羅的なmiRNA発現解析、遺伝子導入手技等を用いて、病態を解明し、今後の遺伝子治療を展開したい。その中で、特に好中球が放出する好中球細胞外トラップ（Neutrophil extracellular traps, NETs）に注目している。
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| Outline of Annual Research Achievements |
敗血症では免疫抑制状態が生じ予後不良を来すが、我々は血球や血管内皮細胞が産生するmicroRNAが、炎症病態を修飾する重要な要因になると考える。その機序と新しい治療法を見出すために、網羅的なmiRNA発現解析、遺伝子導入手技等を用いて病態を解明し、今後の遺伝子治療を展開したい。特に好中球が放出するNETsに注目している。
ヒト骨髄性白血病細胞HL-60細胞を、ジメチルスルホキシド（DMSO）にて好中球に分化し実験を行った。HL-60 培養細胞株を用いて、in vitro での分葉核の形成と NETs 類似の構造体の誘導系を確立した。糖濃度の異なる培養液を用いた好中球の培養系において、LPSを含有する培養液で24-48時間培養後、ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸塩（PMA）負荷し、好中球の脱顆粒化、NETs、ヒストンを蛍光色素染色後、蛍光倒立顕微鏡で観察、また培養後の回収液をフローサイトメーターで定量化し、対象群と比較検討した。さらに細胞からTotal RNAを分離し、次世代シーケンサーを用いてmRNA及びmiRNAの発現の網羅的解析を、CLCバイオ社解析ソフト（Genomic Work Bench）を使用して行った。特にNETsを含む、細胞死・炎症惹起物質に関連するmRNA、及びそれに相補配列のあるmiRNAを選別した。Real-Time PCR法で、RNA発現の絶対定量を行った。また、上記の実験で上昇したmiRNAのmimic（Pre-miRTM miRNA Precursor Molecules, Ambion社）と、そのmiRNAに特異的なmiRNA阻害薬（Anti-miRTM miRNA Inhibitor, Ambion社）をHL-60 培養細胞株へ遺伝子導入し、好中球の脱顆粒化、NETs、ヒストンを蛍光色素染色、フローサイトメトリーで、比較検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナ禍で、外部委託業者の出勤時間、営業時間が限られていたため、一部の実験に遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
（臨床研究）ICU入室患者を対象に、1)非敗血症患者、2) 耐糖能障害の無い敗血症患者、3) 耐糖能障害の有る敗血症患者から採血後、好中球を抽出し、細胞培養研究で検討した好中球の脱顆粒化、NETs、ヒストンの発現、及びmiRNA発現のデータの比較検討を行う。
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