New approach for the mechanisms of septic encephalopathy based on cyclophilin D signal transduction and mitochondrial permeabilty transition pore structure
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20K09255
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55050:Anesthesiology-related
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
内野 博之 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (60266476)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石田 裕介 東京医科大学, 医学部, 講師 (40805884)
柴田 勝一郎 東京医科大学, 医学部, 助教 (70869429)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | シクロフィリンD KOマウス / ミトコンドリア / マイトファゴソーム / 敗血症性脳症 / CyclophilinD KO マウス / 酸化ストレス / Cyclophilin D KOマウス / NRF2 / microRNA / Protein array / サイトカイン / ケモカイン / 敗血症関連脳症 / ミトコンドリア機能不全 / シクロフィリンD / MPT pore / 電顕 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、敗血症関連脳症（SAE）の実態を脳内MPT誘発ミトコンドリア機能不全の中心的役割を担うミトコンドリア内のCyclophilin D（CypD）と脳内抗酸化ストレス機構のGSH/Nrf2を機軸とした情報伝達系および細胞内ミトコンドリアのクリアランス機構であるオートファジー、殊に、mitophagyに果たす役割解明に展開し,MPTの中心的構成要素と考えられるCypD・ANT・VDACの構造解析をクライオ電子顕微鏡にて解析し、SAEにおけるCypD/GSH/Nrf2情報伝達系の連関、役割解明とMPT pore（MPT孔）構造の特定を試みる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリア選択的なオートファジーであるmitophagyの検証と役割の検討を主たる目的とした。SAE誘発における脳マイトファジー形成の検証とCypD情報伝達系のマイトファジー発現に果たす役割の解明について第8-10週令の雄性C57B6マウスのwild群、CypD KO群を用いてSAEモデルを作製し、モデル作製６、１８時間後（各時間・両群、各群のshamとも５匹ずつのマウスを使用）に4℃ ２％パラホルムアルデヒド＋2.5%グルタールアルデヒド添加0.1Mリン酸バッファー溶液で灌流固定する。大脳（視交叉より2mm後方）の冠状断面で２ｍｍの切片を切り出し、3%グルタールアルデヒド＋1%リン酸バッファー4酸化オスミウムにて固定後にエポン包埋し0.12mmで薄切切片を作成し、0.2%クエン酸鉛+1%酢酸ウランにて染色した後に走査電顕にてマイトファゴソーム形成の有無を解析を行った。抗LC3B抗体と抗p62抗体を用いたimmunoblottingを行い、デンシドメトリーにてLC3-II(脂質修飾型)/LC3-I比（マイトファゴソーム形成・量を反映）、p62の減衰スピード（分解能を反映）を評価し、SAE誘発・脳マイトファジー形成を検証・定量化し、CypD情報伝達系のマイトファジーに果たす役割を解明することも同時に行う予定とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
走査電顕にてマイトファゴソーム形成の有無を解析すべく、サンプル調整を行い電顕による薄切切片を作成したが、マイトファゴソーム形成を得ることができなかったため。抗LC3B抗体と抗p62抗体を用いたimmunoblottingを行い、デンシドメトリーにてLC3-II(脂質修飾型)/LC3-I比（マイトファゴソーム形成・量を反映）、p62の減衰スピード（分解能を反映）までは解析が進まなかったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
再度、走査電顕によるマイトファゴソームの検出を試みる予定である。抗LC3B抗体と抗p62抗体をいくつか試みてimmunoblottingを行い、デンシドメトリーにてLC3-II(脂質修飾型)/LC3-I比（マイトファゴソーム形成・量を反映）、p62の減衰スピード（分解能を反映）の解析を行う。
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Report
(3 results)
Research Products
(3 results)
