Construction of the conditional knock out mouse which is specifically controlled endothelial cell in mouse brain
| Project/Area Number |
20K09376
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56010:Neurosurgery-related
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| Research Institution | Meiji Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
望月 靖子 (田中 靖子) 明治薬科大学, 薬学部, 講師 (20386452)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | AQP11 / コンディショナルノックアウトマウス / AQP / 脳 / アクアポリン / 血管内皮細胞 / 病態モデル |
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| Outline of Research at the Start |
AQP11は胎児期から成体まで全身で発現しているが、従来のAQP11KOマウスは多発性嚢胞腎となり生後１ヶ月以内に死亡する。これは研究上の障害となり、AQP11KOマウスの表現型を詳細に調べることが不可能であった。そこで本研究では、脳におけるAQP11の役割を明らかにする目的で、脳で特異的に制御可能なAQP11コンディショナルKOマウスを作成する。「多発性嚢胞腎に影響されない」かつ、「AQP11の欠損が脳で直接的に影響をうける」オリジナリティのあるモデルマウスを作成する。これにより、新たな手法でAQP11の役割を解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
水チャネルアクアポリン11（AQP11）の役割を明らかにするため、その方策を検討し研究を進めている。これまでに、AQP11は胎児期から脳、腎、胸腺などの主要組織で発現していることを示してきた。しかしながら、その役割は水を通す以外に完全に解明することができていない。これまではAQP11欠損マウスを用いてAQP11が欠損した場合の表現型を調べていた。その方法はcre-loxPシステムを用いた遺伝子欠損マウス作成方法である。この方法で作成したAQP11欠損マウスでの一番わかりやすい表現型は多発性嚢胞腎であり、生後１ヶ月以内に死亡する。AQP11も全身の広範囲に発現しているにも関わらず、幼若なうちに死亡してしまうので、詳細の形態変化や役割を解明するには大きな障害となる。これを回避すべく、AQP11が発現する脳部位特異的な遺伝子を選び、その遺伝子に対するコンディショナルノックアウトマウスを作成する。このモデルによりAQP11を欠損した影響が多発性嚢胞腎形成に影響される時期か否かも明らかにすることができる。多発性嚢胞腎に影響されずに脳でのAQP11の影響も明らかにすることができる。さらには、コンディショナルノックアウトマウスを用いて脳梗塞モデルマウスも作成し、これまでにも申請者が研究している脳浮腫の制御とAQP11の関与をより明らかにすることで、これまでと異なる視点から脳浮腫を制御させる応用へと繋げる基礎的な治験を得る。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
研究開始時の目的と同様、まずはAQP11を脳の特定の部位で欠損させるコンディショナルノックアウトマウスを作成することが目的である。当初予定していた遺伝子の候補の幾つかは、AQP11の発現部位と同じ細胞で発現していても、それ以外の部位でも発現していると思われるものもあり、さらに遺伝子の選択に戻っている。脳でのAQP11は脳血管内皮細胞の細胞膜に発現していることを示したが、昨年度はさらに、脳血管内皮細胞モデル細胞である条件不死化細胞TM-BBBでの発現部位が細胞質、細胞膜、核の順で発現に差があれど発現していることを報告した。これらは検討不十分でさらに再検討した。それによりさらにコンディショナルノックアウトマウスの遺伝子選択を慎重に行うべきであると判断した。コンディショナルノックアウトマウスの対象遺伝子の選択は、報告されている遺伝子でも市販の抗体がない場合もあり、検討時間を予想以上に要してしまったことも理由とされる。さらなる候補となる遺伝子の発現部位を検討し、進めていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
コンディショナルノックアウトマウス作成にあたり、AQP11と同時に脳血管内皮細胞で発現するあらたな他の遺伝子を再検討する。該当遺伝子のタンパク発現に対して、脳全体での免疫染色、脳の各部位（血管、グリア細胞、神経細胞）を分割した後にウエスタンブロットを行い、mRNAの発現についてはRT-PCR、RT-qPCRを行い、同じ部位で発現することを慎重に検討の後、サブクローニングして、マウス作成へ繋げる。コンディショナルノックアウトマウス作成後はAQP11欠損による表現型を脳を中心に全身を調べ、その影響を明らかにする。主に各組織の組織切片を作成して解析する。
さらに、変更ではないが、コンディショナルノックアウトマウス作成後も脳毛細血管の血管内皮細胞において、浸透圧変化とAQP11の関係を明らかにするためにも、別の視点から検討を同時進行させる。方法は、これまで使用していた条件不死化細胞TM-BBBを用いて浸透圧を変化させた培養条件を用いる。浸透圧を変化させた培養条件によりAQP11の発現量の変化および発現部位の変化を解析する。それにより、特異の条件下で機能するAQP11の役割が明らかになると期待される。
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Report
(3 results)
Research Products
(1 results)
