自然免疫応答を介した蝸牛内炎症により生じる難聴の病態およびメカニズム解明
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20K09729
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56050:Otorhinolaryngology-related
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
中西 啓 浜松医科大学, 医学部, 助教 (20444359)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
細川 誠二 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (50377743)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2021: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 難聴 / 蝸牛 / 免疫応答 / 自己免疫 |
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| Outline of Research at the Start |
我々は遺伝性難聴家系の連鎖解析を行い、難聴がNLRP3遺伝子変異により生じていることを明らかにした。この家系における難聴の病態として、NLRP3の機能獲得型変異により、蝸牛内に存在する組織マクロファージからIL-1βが分泌されたために、蝸牛内炎症が惹起され難聴が生じたという仮説を立てた。本研究では、モデルマウスを用いてこの仮説を証明することが目的である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は非症候群性遺伝性難聴家系（DFNA34）の連鎖解析を行い、本家系の難聴がNLRP3遺伝子変異により生じていることを明らかにした。現在までに、NLRP3は全身性自己炎症性疾患であるクリオピリン関連周期熱症候群（cryopyrin associated periodic syndrome: CAPS）の原因遺伝子であることが知られている。CAPS患者では、NLRP3の機能獲得型変異により自然免疫担当細胞から恒常的にInterleukin-1β（IL-1β）が分泌されるために全身性炎症が生じると考えられている。DFNA34患者では難聴以外に臨床症状が認められないため、機能獲得型変異により全身性炎症が生じ、その一部症状として蝸牛内炎症が生じたとは考えにくい。そこで我々は、蝸牛内に組織マクロファージが存在し、その細胞からIL-1βが分泌されたために蝸牛内炎症が惹起され非症候群性難聴が生じたという仮説を立てた。本研究では、この仮説を、マウスを用いて証明するとともに、蝸牛内炎症がヒトの難聴疾患と関連しているかについて検討することが目的である。
R2年度に、野生型マウスを用いて、マウス蝸牛でNLRP3インフラマソームが活性化されること、NLRP3インフラマソームが活性化される細胞は組織マクロファージであることを明らかにした。さらに、NLRP3インフラマソームが活性化されIL-1βに反応して、下流の炎症性サイトカインの1つであるIL-6が上昇することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
R2年度に、野生型マウスを用いて、マウス蝸牛でNLRP3インフラマソームが活性化されること、NLRP3インフラマソームが活性化される細胞は組織マクロファージであることを明らかにした。さらに、NLRP3インフラマソームが活性化されIL-1βに反応して、下流の炎症性サイトカインの1つであるIL-6が上昇することを明らかにした。
① 野生型マウス蝸牛でNLRP3インフラマソームが活性化され下流の炎症性サイトカインであるIL-6が上昇する：NLRP3インフラマソームは、活性化されるとIL-1βの分泌を惹起することにより炎症反応を引き起こす。活性化するためには2段階のステップを誘導することが必要である。2段階のプテップを経てIL-1βが分泌される現象は、NLRP3インフラマソームに特異的であるため目的する細胞内でNLRP3インフラマソームが活性化されるか評価するために応用されている。本研究では、野生型マウスより蝸牛組織を分離・培養し、最初のステップを誘導するためにリポ多糖（LPS）を加えて培養し、さらに次のステップを誘導するためにATPを加えて培養して、培養液中のIL-1βの濃度を測定した（LPS+ATP）。その結果、LPS+ATPを加えた群では、何も加えなかった群やLPSのみ加えた群と比較して、有意に培養液中のIL-1β濃度が高かった。さらに、LPS+ATPを加えた群ではIL-6濃度も高かった。
② 野生型マウス蝸牛でNLRP3インフラマソームが活性化される細胞は組織マクロファージである：蝸牛内においてNLRP3インフラマソームが活性化される細胞を同定するため、野生型マウスより蝸牛組織を分離・培養し、最初のステップを誘導するためにリポ多糖（LPS）を加えて培養した。IL-1βに対する抗体で蝸牛組織を染色した結果、一部の組織マクロファージがIL-1βに対する抗体で染色された。
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| Strategy for Future Research Activity |
蝸牛内炎症により難聴が生じるか評価するために、DFNA34家系で同定された変異を用いて新たにNLRP3モデルマウスを作製する。ノックインマウスの作成は、CRISPR/Cas9法によるゲノム編集技術を用いて行う。オフターゲット作用により本来期待していない部位に変異が生じる可能性があるので、野生型マウスと数世代交配してオフターゲット変異を持たないマウスを選別する。作製したNLRP3ノックインマウスにおいて、体重、皮疹、生存期間を観察するとともに、全血球計算や血液中のサイトカイン濃度を測定する。また、聴覚機能についても評価する。それぞれについて、詳細を以下に記載する。
①体重、皮疹、生存期間の観察について：作製したNLRP3ノックインマウスにおける全身性炎症や成長障害を評価するために、体重、皮疹、生存期間を観察し、野生型マウスと比較する。なお、皮疹の評価は、視診および皮膚組織切片を観察して評価する。
②全血球計算や血液中のサイトカイン濃度の測定について：全身性炎症が惹起されているか、惹起されているとしたらどの程度の炎症がいつ頃から惹惹起されているのか評価するために、全血球計算や血液中のサイトカイン濃度を測定する。全血球計算では、赤血球数、白血球数、白血球分画、血小板数を自動血球計算装置により測定する。また血液中のサイトカインに関しては、IL-1β、IL-6、TNF-α濃度をELISA 法により測定する。
③聴覚機能の評価について：聴力障害の有無について評価するために、マウスの聴力をABR およびDPOAEを用いて測定する。
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Report
(1 results)
Research Products
(11 results)
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[Journal Article] Postoperative course of pars flaccida cholesteatoma patients with habitual sniffing2020
Author(s)
Endo S, Mizuta K, Takahashi G, Arai M, Nakanishi H, Takizawa W, Hosokawa K, Yamatodani T, Misawa K, Hosokawa S, Mineta H
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Journal Title
Otol Neurotol
Volume: 41
Pages: e1214-e1218
DOI
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Peer Reviewed
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