β3インテグリン遺伝子導入ヒト表皮角化細胞を用いた難治性潰瘍に対する新規再生医療

Research Project

Project/Area Number	20K09847
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 56070:Plastic and reconstructive surgery-related
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	久保美代子岡山大学, 医学部, 客員研究員 (00098609)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	牧野英一岡山大学, 医学部, 客員研究員 (90314674) 山本健一岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (00711798) 木下理恵岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (40518297)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywords	β3遺伝子導入ヒト表皮角化細胞 / 難治性潰瘍 / フィブリンゲル / 変性コラーゲン / 正常ヒト表皮角化細胞 / フィブロネクチン / α5インテグリン / β3インテグリン / 再生医療 / 再上皮化促進 / β3インテグリン遺伝子導入ヒト表皮角化細胞 / 細胞治療 / αvβ３インテグリン / 遺伝子導入ヒト表皮角化細胞
Outline of Research at the Start	難治性潰瘍（慢性創傷）の治療は現在までに種々の改善がなされてきた（培養皮膚、増殖因子投与、創傷被覆材開発、物理的治療など）。しかし、その結果はまだまだ十分とはいえない。われわれは本研究において独自の細胞（β3インテグリン遺伝子導入ヒト表皮角化細胞）を用いて種々の難治性潰瘍（慢性創傷）を治療する新規再生医療（細胞治療）を開発する。すなわち、ex vivo 遺伝子治療によるアプローチである。本研究では当開発細胞の臨床応用に向けて、①当開発細胞を用いて行う再生医療の至適条件を確立する。また、②認められる創傷治癒促進効果の分子機構を明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	難治性潰瘍部には変性コラーゲン（gelatin: GEL）も多く局在する。本年度はGEL上での正常ヒト表皮角化細胞（NHK）とαvβ3発現HKのin vitro細胞増殖について調べた。96 well plateを用いて、4日間の細胞増殖アッセイ(CCK-8 assay)を行った。Sigma社製gelatin (豚皮膚、type A)を2種類の方法：(a)オートクレーブ法（121℃、20分）、(b)煮沸法（50℃、20分）で調整し、種々の濃度(0-20,000 μg/ml)のGEL上でNHKとαvβ3発現HKとを培養した。無血清・低Ca 培地（KGM-Gold BulletKit、Ca濃度: 0.1 mM)を使用した。その結果、NHKの細胞増殖は、両GELともその低濃度 (10-100μg/ml)で著明に減少した。そしてオートクレーブ法での高濃度GEL (1,000-20,000μg/ml) でNHKの細胞増殖の増加はごく軽度であったが、煮沸法での高濃度GEL（1,000-20,000μg/ml）ではNHKの細胞増殖が著明に増加し、αvβ3発現HKのそれと同じ程度であった。またαvβ3発現HKの細胞増殖はNHKに比べて煮沸法での高濃度GEL上でのそれを除くすべてで有意に増加した(Student's t-test: p<0.0001) 。同アッセイ後の細胞形態については細胞増殖が抑制されたNHK（両GELとも10-100μg/ml）で細胞伸展が著明に減少した。加えて、同NHKではF-actin、vinculin分布の著明な減少があった。また、αvβ3発現HKではNHKに比べてフィブロネクチン分布が増加した。さらに、煮沸法GEL高濃度（10,000μg/ml）においてαvβ3発現HKでα5、β3インテグリン発現の増加、NHKでα5インテグリン発現の増加があった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason コロナ禍の状況で研究体制がかなり制限された時期があったため。
Strategy for Future Research Activity	1. NHKあるいはαvβ3発現HKと線維芽細胞とを併用投与した際のフィブリン（FB)ゲル上でのin vitro細胞機能 (接着、増殖、移動) を調べる。 2. NHKあるいはαvβ3発現HKと線維芽細胞とを併用投与した際のin vivo難治性潰瘍モデル（フィブロネクチン除去FBゲル使用）における細胞機能（生着率、再上皮化）への効果を検索する。また、FBにGELを混合したゲル上でのin vivo細胞機能（生着率、再上皮化）への効果も調べる。 3. αvβ3発現HKを臨床で使用する際の安全性をさらに確認するために実験を繰り返し、n数をふやす。 4. αvβ3発現HKの創傷治癒促進 (再上皮化促進) 効果の分子機構を網羅的RNAシークエンス解析等によりさらに解析する。