ガウシアルシフェラーゼを用いたインスリン分泌解析の新展開
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20K09886
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57010:Oral biological science-related
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| Research Institution | Aichi Gakuin University |
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Principal Investigator |
鈴木 崇弘 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (70298545)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横川 慧 愛知学院大学, 薬学部, 講師 (40804406)
古野 忠秀 愛知学院大学, 薬学部, 教授 (80254308)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 生物発光イメージング / インスリン分泌 / ガウシアルシフェラーゼ / 開口分泌 / エキソサイトーシス |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、糖尿病発症の鍵となる周期性インスリン分泌の破綻を解明するための有用な解析手法の確立を目的として、新たなインスリン分泌の可視化法と定量解析系を開発する。独自の技術として、インスリンをガウシアルシフェラーゼ（発光酵素）標識したタンパク質を用いた、「生物発光イメージング法」によりインスリン分泌を可視化する。これと合わせて、簡便な「ルミノメーターを用いた発光検出法」を駆使することで、従来よりも生理的な実験条件でのインスリン分泌解析系を確立する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまでに、ヒトインスリンとガウシアルシフェラーゼ（Gaussia Luciferase, GLase）の融合タンパク質（Insulin-GLase）をレポーターとして用いて、独自開発の「分泌タンパク質の生物発光イメージング法」で、インスリン分泌動態を可視化している。本手法を用いて、膵島と同様に、細胞塊（スフェロイド）でグルコース応答性の周期性インスリン分泌を示すことを特長とする、Insulin-GLase定常発現ラット膵β細胞株（iGL細胞）を樹立している。
今回、iGL細胞を用いたルミノメーターによる発光測定系でグルコース応答性インスリン分泌を解析するための最適な実験条件を確立した。ポリDリジンでコーティングしたマルチウェルプレートでは、自作および既製品を含め、毒性が出て死細胞が多くなることがあり、グルコース応答性にもバラツキが見られた。一方、8倍希釈したマトリゲルでコーティングした自作プレートでは細胞の接着性が良く、細胞の洗浄操作が容易になり、実験結果の再現性が高まることが確認された。このとき、比較的高密度で播種し、48時間培養したiGL細胞はシート状に広がり、グルコース応答性インスリン分泌の応答率と分泌量が高いことが確認された。また、低グルコース処理の前段階での細胞の洗浄ついては、高グルコース（11~20 mM）刺激の応答率を解析する上では必須ではなく、低グルコース処理は0~2 mM で行うのが良いことがわかった（3 mM グルコースでは分泌量が少し上昇するために、応答率が低くなった）。
また、GLase融合タンパク質を用いた生物発光イメージング法を適用し、膵β細胞の増殖に関与するオステオプロテゲリンについて、骨芽細胞からの分泌動態を可視化した。オステオプロテゲリンは、骨芽細胞から高頻度に分泌され、開口分泌部位は細胞全体に広がっている様子が可視化された。
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Report
(4 results)
Research Products
(9 results)
