| Project/Area Number |
20K09915
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57020:Oral pathobiological science-related
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| Research Institution | Fukuoka Dental College |
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Principal Investigator |
日高 真純 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 教授 (80238310)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤兼 亮輔 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 講師 (20581713)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | DNA損傷応答 / 胞周期チェックポイント / アポトーシス / ATR/CHK1 / 化学療法剤 / 細胞周期チェックポイント / 多能性幹細胞 / 細胞死 / ストレス超感受性 / ゲノム安定化 |
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| Outline of Research at the Start |
多くの抗がん剤はDNAに損傷を与えるが、応答するしくみは細胞の種類によって異なっている。がん細胞やそれが由来する体細胞はDNA損傷に応答して傷の修復を試みるが、修復がうまくいかない場合は突然変異や染色体異常を伴う。一方、多能性幹細胞はDNA損傷に対して高度に感受性で、修復することはせずに優先的に細胞死を選択することで高度なゲノム恒常性を維持している。しかし、その詳細な分子機構は未だ明らかになっていない。本研究では、ヒトiPS細胞とがん細胞におけるDNA損傷応答の違いを検証しつつ、ヒトiPS細胞のストレス超感受性に関わる因子を網羅的に探索することで、高度なゲノム恒常性維持機構の解明をめざす。
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くの抗がん剤はDNAを損傷し、増殖の盛んな細胞に対して複製ストレスを与えるが、応答するしくみは細胞の種類によって異なっている。がん細胞やそれが由来する体細胞はDNA損傷に応答して細胞周期を停止し傷の修復を試みるが、修復がうまくいかない場合は突然変異や染色体異常を伴う。一方、多能性幹細胞は DNA損傷に対して高度に感受性で、僅かなストレスを受けた場合でも修復することはせずに優先的に細胞死を選択することで高度なゲノム恒常性を維持している。そこで本研究は、細胞がストレスに応答して生死を決定する分子メカニズムを明らかにすることで、多能性幹細胞が有する高度なゲノム恒常性維持機構の解明と低濃度で作用する新たな抗がん療法の開発に向けた分子基盤の確立を目的に計画されたものである。
申請者はこれまでにDNA損傷が引き起こす細胞死誘導において、クロマチン動態と損傷応答シグナリングのトランスアクションが重要であるとの知見を得てき た。そこで令和5年度は、複製ストレス応答への関連が報告されているFANCD2の化学療法剤感受性に及ぼす影響についての解析を昨年度から継続して行った。その結果、FANCD2遺伝子のノックアウト細胞は抗がん剤に対して著しい感受性を示すことを明らかにした。この時、53BP1のnuclear fociが有意に増加し、それと同時に、DNA相同組換え反応に関わるRAD51とCtIPの損傷クロマチンへ結合が有意に低下していた。この結果は、複製ストレス応答時のFANCD2の機能不全は細胞死を優先的に選択する要因となり得ることを強く示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請者はヒトiPS細胞において、DNA損傷後もチェックポイントキナーゼATR/CHK1は活性化されず、高感度に細胞死が誘導されることを検証してきた。また、MSH2遺伝子のノックアウト細胞を構築し、この細胞死誘導にミスマッチ修復因子が必要であることも見出している。 そこで令和5年度にはヒトiPS細胞とヒトがん細胞のDNA損傷応答機構を比較することを目的して、ヒト子宮頸癌由来細胞株HeLaを実験材料に用いて、複製ストレス応答への関連が報告されているFANCD2のアルキル化抗がん剤感受性に及ぼす影響についての解析を継続して行った。その結果、構築したFANCD2遺伝子のノックアウト細胞ではアルキル化剤MNUに対する感受性が顕著に亢進することが明らかとなった。FANCD2ノックアウト細胞がアルキル化剤超感受性を示す原因を解析したところ、FANCD2ノックアウト細胞ではアルキル化剤処理後に53BP1のnuclear fociを指標としたDNA二重鎖切断が蓄積すること、また、この時にDNA相同組換えで機能するRAD51とCtIPの損傷クロマチンへの結合が低下することを見出している。このことから、FANCD2は損傷クロマチンへ相同組換え因子をリクルートし、DNA損傷に起因して生じる複製ストレスを緩和する機能を担っていることが示唆された。この成果を論文としてまとめ、現在国際誌Molecular Biology Reportsへ投稿中である。よって、現在までの進捗状況は概ね順調に進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
多能性幹細胞であるヒトiPS細胞とこれまで細胞死誘導研究に利用してきたヒトがん由来培養細胞との比較を行いながら、以下の実験に取り組む。
(1)がん培養細胞との比較によるヒトiPS細胞におけるチェックポイント活性化回避の検証
ATR/CHK1経路の活性化回避が細胞のストレス応答時の生死決定メカニズムと密接に関連していることを見出したので、ATR/CHK1経路の活性化に関与することが報告されているTopBP1とETAA１のDNA損傷応答における機能を解析する。がん細胞においては、TopBP1とETAA１遺伝子のノックダウン細胞はすでに構築済みで、それらがアルキル化剤処理後のDNA損傷応答の低下を示し、感受性を亢進することを見出している。同様な実験をヒトiPS細胞を用いて行い、TopBP1とETAA１のチェックポイント活性化回避における機能を検証する。
(2)ストレス超感受性に関連するタンパク質の網羅的な同定
アルキル化剤処理された細胞が、どのようにその生死を決定しているかを明らかにするために、ヒトがん細胞とヒトiPS細胞を用いて、DNA損傷が引き起こす細胞死の誘導過程で発現変動する遺伝子を次世代シークエンスによるRNA-seq法により同定する。ヒトがん細胞においては既に実施済みで、発現がアップする遺伝子を138個、ダウンする遺伝子を47個見出している。同様な解析をヒトiPS細胞を用いても行い、見出された候補遺伝子の中からストレス超感受性に関連する遺伝子の同定を行う。
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