Development of biomarkers targeting myeloid-derived suppressor cells in oral cancer precision medicine

Research Project

Project/Area Number	20K10166
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 57060:Surgical dentistry-related
Research Institution	Kagoshima University
Principal Investigator	別府真広鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 助教 (00363648)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	杉浦剛鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 教授 (40322292) 比地岡浩志鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (70305150)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help	¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000) Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2020: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Keywords	口腔癌 / CTC / マイクロ流体チップ / 骨髄由来免疫抑制細胞 / 口腔癌個別化療法 / バイオマーカー
Outline of Research at the Start	癌の発生において、何らかの遺伝子異常によって出現した変異クローン細胞が腫瘍化し、多段階的に「悪性化」し、「転移能」を獲得して転移腫瘍を形成すると考えられている。腫瘍局所の微小環境においては腫瘍のみならず、近接する間質細胞においても不均一性を持つことが知られており、原発病変と転移病変でがんの発生・進展において遺伝子変異パターンが異なる可能性が示唆されている。今回我々は癌と相互的に影響し、腫瘍の免疫回避に寄与するとされている骨髄由来免疫抑制細胞（MDSC）をターゲットとし、口腔癌の原発巣、転移巣、末梢血中のMDSCの遺伝子変異の比較を行い、個別化療法を目標としたバイオマーカーの開発を試みる。
Outline of Annual Research Achievements	われわれは現在まで口腔がんにおいて循環腫瘍細胞（CTC）をターゲットとしたリアルタイム個別化療法を検討してきたが、今回はがんと相互的に影響を与え、活性化しあうことが知られている間質細胞、中でも腫瘍の免疫回避に寄与するとされている骨髄由来免疫抑制細胞（MDSC）にターゲットを絞り、次世代シーケンス（NGS）を用い、原発巣、転移巣、末梢血中のMDSCの遺伝子変異の比較による、プレジションメディシン（精密医療）を目標とした本研究を着想した。（１）動物転移モデルにおける原発巣、転移巣、末梢血内、CTC間の遺伝子比較：動物転移モデルは当研究室で樹立した腺様嚢胞癌細胞株及び扁平上皮癌細胞株を用いた転移モデルを用い、原発巣および転移巣における腫瘍組織を採取して細切しシングルセル化し、NGS解析を検討中である。（２）患者原発巣癌細胞、転移巣、末梢血内、CTC間の遺伝子比較：未治療の段階で得た生検手術材料および患者血液から分取した細胞を用いて、上記転移動物モデルと同様の手法を用いて、各群間の遺伝子発現比較を行う。現在当科を受診しSCCと診断され、手術を行った患者を対象とし、手術もしくは生検から採取した腫瘍組織および、術前、術中、術後の採血から採取されマイクロ流体チップを用いて分離したCTCを用い、検出を行った。原発巣から得られた腫瘍細胞とCTCはFoundation One CDxがんゲノムプロファイルを基にpanelを作成し sequenceを行われた。ctDNAは経時的に観察するためにCTCと同タイミングで採取し、解析中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason われわれは現在まで口腔がんにおいて循環腫瘍細胞（CTC）をターゲットとしたリアルタイム個別化療法において、現在上記の動物転移モデルにおける原発巣、転移巣、末梢血内、CTC間の遺伝子比較においては、CTCの採取やシングルセル採取が技術的に困難であり、NGS解析まで至っていないのが現状である。一方で同時に行っていた患者原発巣癌細胞、転移巣、末梢血内、CTC間の遺伝子比較においては、現時点で10例の症例において、手術もしくは生検から採取した腫瘍組織および、術前、術中、術後の採血から採取されマイクロ流体チップを用いて分離したCTCを用い、検出を行い、NGS解析中である。一方で当初ターゲットとしていた骨髄由来免疫抑制細胞（MDSC）の検出に関する、フローサイトメトリー(FACSAria; Becton Dickinson)による、CD11b+Gr-1+のMDSC細胞分画からLy6GhighLy6Clowである顆粒球系MDSCとLy6G-Ly6Chighである単球系MDSCを分取し、次世代シークエンサーを用いてRNA-Seq解析を行い、それぞれの細胞の発現プロファイルのheatmap及び主成分解析によりMDSC細胞のクラスタリングを行い、特徴的な遺伝子発現を解析する点において進捗していない。
Strategy for Future Research Activity	現在上記の動物転移モデルにおける原発巣、転移巣、末梢血内、CTC間の遺伝子比較および、患者原発巣癌細胞、転移巣、末梢血内、CTC間の遺伝子比較においては、NGS解析も含めある程度進行中である。今後は当初ターゲットとして予定していた、骨髄由来免疫抑制細胞（MDSC）の検出に関する、フローサイトメトリー(FACSAria; Becton Dickinson)による、CD11b+Gr-1+のMDSC細胞分画からLy6GhighLy6Clowである顆粒球系MDSCとLy6G-Ly6Chighである単球系MDSCを分取に関してまずは技術的な面から習得および習熟する予定である。