非ベンゾジアゼピン系睡眠薬を標的とした抗体ファージライブラリーの構築と検出法開発
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20K10557
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 58040:Forensics medicine-related
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
笹尾 亜子 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (80284751)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山口 佳宏 熊本大学, 環境安全センター, 准教授 (10363524)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 免疫学的検出 / 薬毒物スクリーニング / 非ベンゾジアゼピン系睡眠薬 / 抗体ファージライブラリー / 向精神薬 / 法医中毒学 / 組換え抗体 / 免疫学的検出法 / 薬物スクリーニング / 非ベンゾジアゼピン系 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、非ベンゾジアゼピン系睡眠薬（ゾピクロン、ゾルピデム）を標的とした抗体ファージライブラリーの構築を行ってその検出法を開発する事を目的とする。具体的には、これら薬物に反応性の高い抗体ファージライブラリーを作製、構築したライブラリーを用いて薬物に親和性の高いファージを選別、その抗体遺伝子を解析する。抗体タンパク質発現ベクターを作製し、調製した抗体の特性を調べた上で薬物検出法を構築するものである。
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| Outline of Annual Research Achievements |
法医解剖や検屍・検案時の死因診断において、その死因に薬物が関与したかを確認する事は極めて重要である。現在、その検査手段として免疫学的検出法を用いた簡易薬物検査キットが幅広く利用されている。免疫学的検出法は、簡便に対象薬物を検出できるため急を要する現場では最適なスクリーニング法である。
これまで我々は、新規薬物に対する免疫学的簡易検出法を組換え抗体技術を利用して提供する体制作りを行ってきた。特に、抗体検索に有用な抗体ファージライブラリーの構築は、迅速な薬物検出法の構築に大いに貢献できると考えている。そこで我々は、近年処方が拡大している非ベンゾジアゼピン系睡眠薬を標的とした抗体ファージライブラリーの構築とその検出法の開発を本研究課題の目的とした。
本年度は、非ベンゾジアゼピン系睡眠薬ザレプロンに対する組換え抗体の作製を実施した。まず、昨年度までに調製した抗ザレプロン抗体遺伝子についてその抗体遺伝子配列の特定を行った。（進捗1：抗ザレプロン抗体遺伝子のシークエンス解析）。次に特定した抗体遺伝子を検出系として用いる予定のQuenchbody（Q-body）発現遺伝子に挿入した。（進捗2：Q-body発現遺伝子の構築）。今後は、この組換え抗体のザレプロンやその代謝物との結合能を検討していく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、上記概要に述べたように非ベンゾジアゼピン系睡眠薬ザレプロンに対する抗体遺伝子のシークエンス解析とQ-body発現遺伝子の構築を以下の通りに実施した。
そのため、おおむね順調に進展していると評価する。以下に詳細を記す。
1）抗ザレプロン抗体遺伝子のシークエンス解析：昨年度樹立したハイブリドーマ株のうちPM Q-probeを用いた評価の結果Q-bodyに適していると予想された２株を用いて、total RNAを精製してcDNAを合成した。これに対して軽鎖および重鎖の可変領域増幅用プライマーを用いて各抗体遺伝子をクローニングし、シーケンス解析を行った。解析結果を元にKabatデータベースに基づくアミノ酸配列のアノテーションを行ったところ、2種の抗体（MRZ13、MRZ45）は軽鎖におけるCDR領域で２つのアミノ酸配列が、重鎖ではCDR領域で6つ、FR領域で8つのアミノ酸配列が異なる事を確認した。
2）Q-body発現遺伝子の構築：上記の抗体遺伝子を挿入した一本鎖抗体型Q-body発現遺伝子2種を構築した。この抗体遺伝子は精製目的にFLAGとHisのタグ配列を挿入してある。これを用いてタンパク質発現用大腸菌SHuffle T7 express lysYの形質転換を行った。発現実験の結果、大腸菌可溶性画分に少量の、不溶性画分に多量の目的タンパク質の発現を認めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、作製した抗ザレプロン一本鎖抗体を用いてザレプロンやその代謝物にどの程度の結合活性を示すか確認を行う。さらに、検出系としてQ-body反応系での蛍光応答性について、生体試料も含めた試料を用いて検定を行う。また、結合活性の強い抗体遺伝子を鋳型としたファージライブラリーの作製を進める予定である。
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Report
(3 results)
Research Products
(1 results)
