哺乳類細胞内における短鎖RNA転写の光制御技術開発とその応用

• Project/Area Number: 20K15394
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 37010:Bio-related chemistry
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 河野 風雲 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (20786090)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2021: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000); Fiscal Year 2020: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
• Keywords: 光遺伝学 / タンパク質工学 / RNA生物学 / 遺伝子発現制御

Outline of Research at the Start

本研究では「哺乳類細胞内における短鎖RNA転写の光制御技術開発とその応用」に取り組む。本研究で開発する技術は、哺乳類細胞内や哺乳動物生体内でRNAの転写を光で自由自在に制御することができるため、従来法では困難であった一細胞レベルでの高い時空間精度でRNA転写を制御することが可能となる。本研究を遂行することにより得られる成果は、現在の光遺伝学技術の基盤底上げに繋がるのみならず、RNA生物学をはじめ、生命科学全般において新しい基盤技術として幅広く多岐にわたり大きな波及効果が期待される。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、哺乳類細胞内における短鎖RNA転写の光制御技術開発とその応用研究に取り組む。近年、転写された後にタンパク質に翻訳されない非コードRNAの機能が徐々に明らかになり、生命科学においてRNAに関する研究が盛り上がりを見せている。加えて、RNA干渉による遺伝子ノックダウン技術の普及や立体構造をとるRNAのアプタマー創薬としての展開、またCRISPR/Cas9に代表されるゲノム編集関連技術の近年における目覚ましい発展に伴って、生きた哺乳類細胞内で短ヘアピンRNAやアプタマーRNA、ガイドRNAを含める短鎖非コードRNAの転写を、高い時空間精度で正確に制御できる技術に対する需要がますます高まっている。したがって本研究では、RNAポリメラーゼIIIによる短鎖非コードRNAの転写を光で自在に制御可能な光遺伝学技術を開発し、RNA干渉技術やRNAアプタマー技術、ゲノム編集関連技術にて当該技術の概念実証を行うと共に、哺乳類細胞内での短鎖非コードRNA遺伝子研究への応用を目指した。本研究では転写抑制因子は用いず、プロモーター上に光受容体を結合させることによる物理的な阻害によって、RNAポリメラーゼIIIの転写を制御する技術開発を行なった。そのために本研究では、光が照射されていない暗状態ではDNAに強く結合し、光が照射されるとDNA上から完全に分離する光受容体の開発にまず取り組んだ。そして、その光受容体をプロモーター上に結合させるために、RNAポリメラーゼIIIによる転写誘導の機能は維持しつつ、DNA結合配列を組み込んだ改変型のプロモーターの開発にも取り組んだ。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

コロナ禍において研究可能な期間が大幅に制限されたが、その中で本年度は、短鎖RNA転写の光制御技術の基盤となる光依存的にDNA結合能を損なうキメラ光受容体を開発に取り組んだ。紅色細菌の一種Rhodobacter sphaeroides由来の青色光受容体RsLOVに着目し、RsLOVが暗状態でホモ二量体を形成し、青色光依存的に単量体化する性質の高度にまず取り組んだ。その結果、RsLOVに遺伝子変異を加え強いホモ二量体形成の性質を示す改変型RsLOVの開発に成功した。さらに、 GAL4タンパク質がホモ二量体形成によってGAL4DNA結合配列に結合できることに着目し、RsLOVにGAL４のDNA結合ドメインを融合させ、暗状態ではDNAに結合し、青色光依存的にDNAから分離可能なキメラ光受容体を開発に成功した。

Strategy for Future Research Activity

本年度開発した技術を基に、RNAポリメラーゼIIIによる短鎖RNAの転写を光で制御可能かどうかの概念実証を行う予定である。蛍光タンパク質やルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を用いて、それらを標的とする短ヘアピンRNAの転写を制御することにより。レポーター遺伝子を時空間的にノックダウンさせるRNA干渉を利用した評価系の構築をまず進める。さらに、CSRIPR/Cas9系のゲノム編集技術を利用して、レポーター遺伝子を時空間的にノックアウト/ノックダウン可能かどうかの評価系を構築し、開発した技術の評価を行う。さらに、Spinachに代表される蛍光性RNAや、MS2ファージに由来するコートタンパク質MCPに特異的に結合するステムループ構造を持ったRNAなどの高次構造を形成するRNAアプタマーを利用して、生きた細胞内で転写を直接可視化し、本技術の時空間精度を反応速度論によって評価することを行う。