Analysis of stomatal movement regulation system under multiple stresses for developing practical basis of stress-resistant plant production

• Project/Area Number: 20K15447
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 齋藤 俊也 東北大学, 工学研究科, 学術研究員 (00825226)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: イオンチャネル / 植物 / リン酸化酵素 / 膜タンパク質 / 電気生理学 / カルシウム / 質量分析

Outline of Research at the Start

近年, 乾燥・病害などに対応できる植物の創生が世界的に求められている。その実現には気孔の開閉を環境に合わせて最適化することが不可欠であるが, 各種ストレスに応じた気孔のキナーゼ(リン酸化酵素)-イオンチャネル(イオン輸送体)間シグナルは一部しか解明されておらず, 複合ストレスに対する植物の応答解析も既存の方法では困難である。そこで,
・ホスホプロテオミクス解析による, 各種ストレス下における気孔のキナーゼ-イオンチャネル間シグナルの全貌の解明
・独自の蛍光プローブを用いた, 様々な複合ストレスに対する気孔の応答解析
を試み, 得られた知見を統合することでストレス耐性植物創生の基盤を作ることを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

当初の研究計画では、【①ホスホプロテオミクス解析】により気孔の全タンパク質のリン酸化解析を行ったうえで【②電気生理測定】によりイオンチャネルとキナーゼの対応関係を割り出す予定であったが、ホスホプロテオミクス解析および【③】で記述した蛍光プローブの実用化が難航しており研究が遅れていた。
しかしここまでの研究過程において、気孔のストレスシグナルの使い分けに重要と思われるアニオンチャネルSLAC1のアミノ酸残基が発覚したため、これらのアミノ酸残基へのリン酸化が気孔の挙動に与える影響を調査するべく、SLAC1の該当アミノ酸残基に疑似リン酸化・脱リン酸化変異を施した植物体を作製中である。また、これらのアミノ酸残基のリン酸化に必要なキナーゼの遺伝子欠損もSALK遺伝子研究所より注文し一通り取り揃えている。今後はこれらの植物体における気孔の挙動を調査することによりチャネルの各リン酸化部位とそれぞれが担う役割を割り出す予定である。
さらに前年度、気孔のCa2+シグナルの種類によって応答する気孔のリン酸化モジュールが異なる可能性があることを報告した。これに関して、リン酸化モジュールとしてCBLをターゲットとし、気孔のCa2+シグナル誘起剤とCBLの対応関係を電気生理実験および精製CBLタンパク質と誘起剤の結合実験により見出すべく、実験の準備を進めている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

前述した通り、当初本研究はホスホプロテオミクス解析により気孔の全タンパク質のリン酸化解析を行ったうえで電気生理測定によりイオンチャネルとキナーゼの対応関係を割り出すという計画であったが、ホスホプロテオミクス解析および蛍光プローブの実用化が難航しており研究が遅れていた。
そのため、これまでの研究過程で発見したSLAC1の重要アミノ酸残基と気孔の挙動の関係性を実際の植物体を用いた実験で明らかにするという方向に研究方針を大幅に転換している。
これにより遺伝子組み換え植物体やCa2+シグナル誘起剤-CBL結合実験の実験系の立ち上げなど当初の計画になかった準備が新たに必要となった。

Strategy for Future Research Activity

前述した通り、SLAC1の重要アミノ酸残基に疑似リン酸化・脱リン酸化変異を施した植物体を作製中である。現在遺伝子導入まで完了しており、抗生物質選抜により導入遺伝子のホモ接合型挿入を確認後実験に使用する。また、これらのアミノ酸残基のリン酸化に必要なキナーゼの遺伝子欠損もSALK遺伝子研究所より注文し一通り取り揃えており、今後はこれらの植物体における気孔の挙動を調査することによりチャネルの各リン酸化部位とそれぞれが担う役割を割り出す予定である。
さらに、気孔のCa2+シグナル誘起剤とCBLの対応関係を電気生理実験および精製CBLタンパク質と誘起剤の結合実験により見出すべく、実験の準備を進めている。以上の実験により、SLAC1を中心とした気孔のCa2+/リン酸化シグナルにより気孔の挙動がどのように制御されているかを解き明かす予定である。

Research Products

• [Int'l Joint Research] ミラノ大学(イタリア)
• [Int'l Joint Research] ミュンスター大学(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] ミラノ大学(イタリア)
• [Int'l Joint Research] ミュンスター大学(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] ムルシア大学/セビリア大学(スペイン)
• [Journal Article] Potassium transporter KUP9 participates in K+ distribution in roots and leaves under low K+ stress (2022)
  • Author(s): Taro Yamanashi, Takeshi Uchiyama, Shunya Saito, Taiki Higashi, Hayato Ikeda, Hidetoshi Kikunaga, Mutsumi Yamagami, Yasuhiro Ishimaru and Nobuyuki Uozumi
  • Journal Title: Stress Biology Volume: 2 Issue: 1 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1007/s44154-022-00074-x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Green Tea Catechins, (－)-Catechin Gallate, and (－)-Gallocatechin Gallate are Potent Inhibitors of ABA-Induced Stomatal Closure (2022)
  • Author(s): Kanane Sato、Shunya Saito、Kohsuke Endo、Masaru Kono、Taishin Kakei、Haruka Taketa、Megumi Kato、Shin Hamamoto、Matteo Grenzi、Alex Costa、Shintaro Munemasa、Yoshiyuki Murata、Yasuhiro Ishimaru、Nobuyuki Uozumi
  • Journal Title: advanced science Volume: 2201403 Issue: 21 Pages: 1-15
  • DOI: 10.1002/advs.202201403
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 植物の脂質修飾型キナーゼによるCa2+シグナリング制御 (2022)
  • Author(s): 齋藤俊也、魚住信之
  • Journal Title: 月刊「細胞」 Volume: 54 Pages: 338-342
• [Journal Article] 4. Potassium transport and its regulation in plants (2021)
  • Author(s): 齋藤 俊也、石丸 泰寛、魚住 信之
  • Journal Title: Japanese Journal of Soil Science and Plant Nutrition Volume: 92 Issue: 2 Pages: 99-107
  • DOI: 10.20710/dojo.92.2_99
  • NAID: 130008024157
  • ISSN: 0029-0610, 2424-0583
  • Year and Date: 2021-04-05
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Calcium-Regulated Phosphorylation Systems Controlling Uptake and Balance of Plant Nutrients (2020)
  • Author(s): Saito Shunya、Uozumi Nobuyuki
  • Journal Title: Frontiers in Plant Science Volume: 11 Pages: 1-11
  • DOI: 10.3389/fpls.2020.00044
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Arabidopsis K+ channel inhibitors for unraveling details of stress signaling mechanism. (2023)
  • Author(s): Shunya Saito, Kanane Sato, Kohsuke Endo, Kyota Suzuki, Masaru Kono, Taishin Kakei, Haruka Taketa, Megumi Kato, Shin Hamamoto, Matteo Grenzi, Alex Costa, Shintaro Munemasa, Yoshiyuki Murata, Mieko Arisawa, Yasuhiro Ishimaru & Nobuyuki Uozumi
  • Organizer: International Workshop on Plant Membrane Biology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Arabidopsis KUP9 is Important for the Translocation of K+ in Roots and Shoots (2023)
  • Author(s): Taro Yamanashi, Takeshi Uchiyama, Shunya Saito, Taiki Higashi, Hayato Ikeda, Hidetoshi Kikunaga, Mutsumi Yamagami, Yasuhiro Ishimaru, Nobuyuki Uozumi
  • Organizer: International Workshop on Plant Membrane Biology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The Role of AtHKT1 in Removing Na from Flowers (2023)
  • Author(s): Takeshi Uchiyama, Shunya Saito, Taro Yamanashi, Megumi Kato, Masaru Tsujii, Hayato Ikeda, Hidetoshi Kikunaga, Toshimi Suda, Sho Toyama, Misako Miwa, Shigeo Matsuyama, Yasuhiro Ishimaru, Nobuyuki Uozumi
  • Organizer: International Workshop on Plant Membrane Biology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] (－)-Catechin Gallate and (－)-Gallocatechin Gallate, Components of Green Tea, are Potent Inhibitors of ABA-Induced Stomatal Closure (2022)
  • Author(s): Kanane Sato, Shunya Saito, Kohsuke Endo, Masaru Kono, Taishin Kakei, Haruka Taketa, Megumi Kato, Shin Hamamoto, Matteo Grenzi, Alex Costa, Shintaro Munemasa, Yoshiyuki Murata, Yasuhiro Ishimaru & Nobuyuki Uozumi
  • Organizer: Plant Calcium Signaling Conference
  • Int'l Joint Research / Invited