胚盤胞に由来する3幹細胞系譜を用いたin vitroでの多倍体胚の発生特性解析

Research Project

Project/Area Number	20K15664
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
Research Institution	Yamaguchi University
Principal Investigator	今井啓之山口大学, 共同獣医学部, 助教(テニュアトラック) (60826155)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help	¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2020: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Keywords	幹細胞 / 胚発生 / 多倍体 / 倍数体 / 倍数性
Outline of Research at the Start	哺乳類特有の繁殖特性の1つである多倍体化胚拒否機構について、本来子宮内で起こる生命現象をin vitroで幹細胞実験系を用いて可視化し、その原因とレスキュー法を探索する。多倍体化が胚を構成する細胞へ与える影響について、明確に検出するために複数の倍数性の系列で比較する。また、胚由来の幹細胞のESC, TSC, XENCの3系譜を用いることで倍数性変動に伴う胚を構成する細胞の特性変化の追跡が可能となる。得られた結果に基づき、将来的にin vivoでの多倍体化胚のレスキュー実験へ展開する。既に産業応用がなされている魚類の多倍体化による増産・育種・品種改良技術を哺乳類家畜への応用が期待できる。
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、哺乳類特有の繁殖特性の1つである多倍体化胚拒否機構について、本来、子宮内で起こる生命現象をin vitroでの幹細胞実験系を用いて可視化する。このin vitroでの結果を受け、多倍体化胚を致死へ至らしめる原因およびレスキュー法の探索を行う。従来の研究においても多倍体化胚の発生可能性を論じた報告は散見されるが、これらの報告では、2倍体と4倍体の比較に終始しており、倍数性に伴って変動する発現遺伝子等の生命現象を十分に捉えきれていない可能性があった。また、in vitroモデルとして胚体に相当する胚性幹細胞のみに着目し、胎盤等の胚体外組織への倍数性変動の影響は研究の対象とされなかった。本研究では、多倍体化が胚を構成する細胞へ与える影響をよりシャープに検出するために複数の倍数性の多倍体胚を作出し、倍数性の系列で比較を行う。また、初期胚に由来する幹細胞系譜である、胚性幹細胞、栄養膜幹細胞、および胚体外内胚葉細胞の全3系譜を用いる。これにより胚盤胞を構成するすべての種類の細胞系譜を反映した幹細胞系譜での特性変化の追跡が可能となる。実験手法としては具体的には、細胞培養により基本的な性状の把握と、分化誘導実験、網羅的解析および動物を用いた実験を予定する。得られた結果に基づき、in vivoでの多倍体化胚のレスキュー実験へ展開する。これにより既に産業応用がなされている魚類の多倍体化による増産・育種・品種改良技術等を哺乳類家畜への応用が期待できる。具体的には、早期成熟や病原耐性などといった付加形質を有する優良家畜増産へ貢献が期待できる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 前年度に行った多倍体胚性幹細胞ならびに栄養膜幹細胞のRNA-seqのin silico解析を行った。また、前年度の課題であった他の幹細胞系譜の樹立の困難性を解決するために、幹細胞の原基である胚盤胞を用いたRNA-seqを行い、幹細胞の解析と並行しつつ同時に解析を行った。その結果、幹細胞及び胚盤胞において倍数性の増加に従って発現の増加または低下する遺伝子群のリストを得た。これらの解析結果から倍数性の変動によりクロマチン構造の調節などに関わるポリコーム複合体の関与を示唆された。これらの因子は従来の報告では全く注目されていなかった因子である。データの整合性を確認するために、NCBI GEOのデータを参照しつつ、候補因子の更なるスクリーニングをおこなっている。
Strategy for Future Research Activity	2021年度においては、網羅的な解析を行い、候補となりうる因子のリストを得ることができた。2022年度においては、このリストを精査した上で、ノックダウンやノックアウト胚、幹細胞株の作出を予定する。ノックダウン・ノックアウトの作出方法としては、ターゲット細胞を胚及び幹細胞とするため、安定かつ毒性の低いとされるアデノ随伴ウイルスベクターを予定する。これらの実験主義については十分に熟知しており、問題なく遂行できると考える。