リソソームからのビタミンB12輸送障害の分子機構解明と治療薬開発への応用

• Project/Area Number: 20K15990
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 47030:Pharmaceutical hygiene and biochemistry-related
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 川口 甲介 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 助教 (80624866)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2020: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
• Keywords: ABCタンパク質 / リソソーム / ビタミンB12 / メタノール資化性酵母 / プロテオリポソーム再構成 / プロテオリポソーム

Outline of Research at the Start

ビタミンB12は必須の栄養素で、先天的なビタミンB12代謝異常は重篤な疾患の原因となる。ビタミンB12の細胞内代謝経路のうち、オルガネラ膜を越えて輸送される機構は未だ不明である。リソソーム内から細胞質への輸送障害の原因として、ATP-binding cassette (ABC)タンパク質ABCD4およびリソソーム膜タンパク質LMBD1の機能不全が報告されている。両タンパク質が関与するリソソームから細胞質へのビタミンB12輸送および輸送障害の生化学的機序について解析を行うとともに、ビタミンB12輸送障害を回復する化合物の探索を行い、有効な治療薬開発につながる分子基盤を確立する。

Outline of Annual Research Achievements

ABCタンパク質ABCD4によるリソソームから細胞質へのビタミンB12輸送の分子機構、および遺伝子疾患で見られるビタミンB12輸送障害の機序について解析を行い、以下に示す結果を得た。
・ABCD4の基質認識部位を解析するために、ABCD4の膜貫通領域を同じファミリー分子であるABCD1と置換したキメラタンパク質を作製し、変異型ABCD4のビタミンB12輸送活性を測定した。その結果、６番目の膜貫通ヘリックスを置換した変異型ABCD4のビタミンB12輸送活性が著しく減少することを明らかにした。さらに変異体を作製し解析を行った。その結果、基質輸送ポア内の細胞質に近い場所に位置する329番目のアスパラギン酸、332番目のスレオニン残基の単独の変異によってビタミンB12輸送活性が著しく減少したことから、これらのアミノ酸残基がABCD4の基質認識に重要なことを明らかにした。また、ポア内部の正電荷の増大がビタミンB12輸送を阻害することも明らかにした。
・ビタミンB12代謝異常の原因となるABCD4遺伝子の変異は７通り報告されている。これらの変異型ABCD4を作製し、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現および細胞内局在を解析した。その結果、N141K，Y319C，R432Qはリソソームに局在化するが酵素としての活性を失っていること、G443-S485delはリソソームに局在化が出来ないこと、D143-181del，E556Gfs，E583Lfsはタンパク質品質管理機構により分解されることにより、リソソームから細胞質へのビタミンB12輸送障害の原因となることが示唆された。

Research Products

• [Journal Article] The lysosomal protein ABCD4 can transport vitamin B12 across liposomal membranes in?vitro (2021)
  • Author(s): Kitai Katsuki、Kawaguchi Kosuke、Tomohiro Takenori、Morita Masashi、So Takanori、Imanaka Tsuneo
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 296 Pages: 100654-100654
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2021.100654
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] リソソーム膜ABCトランスポーターABCD4の基質認識部位の解析 (2021)
  • Author(s): 今井桃香、川口甲介、守田雅志、今中常雄、宗孝紀
  • Organizer: 第94回日本生化学会大会
• [Presentation] ABCタンパク質 ABCD4を介したリソソームから細胞質へのビタミンB12輸送機構の解析 (2021)
  • Author(s): 川口甲介、北井克樹、守田雅志、今中常雄、宗孝紀
  • Organizer: 日本薬学会第141年会
• [Presentation] ABC タンパク質を介したリソソームから細胞質へのビタミンB12 輸送機構の解析 (2020)
  • Author(s): 川口甲介、北井克樹、守田雅志、今中常雄、宗孝紀
  • Organizer: 日本ビタミン学会第72回大会
• [Presentation] リソソーム膜ABCタンパク質 ABCD4のビタミンB12輸送機構の解析 (2020)
  • Author(s): 川口甲介、北井克樹、守田雅志、今中常雄、宗孝紀
  • Organizer: 第93回日本生化学会大会