Suppression of oxidative stress by protein-protein interaction between cytochrome P450 and UDP-glucuronosyltransferase
| Project/Area Number |
20K16045
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 47060:Clinical pharmacy-related
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| Research Institution | Sojo University |
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Principal Investigator |
宮内 優 崇城大学, 薬学部, 講師 (50799947)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2021)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | 薬物代謝酵素 / シトクロムP450 3A4 / bac-mam system / 哺乳動物細胞 / バキュロウイルス / UDP-グルクロン酸転移酵素 / 糖化産物 / 終末糖化産物受容体 / タンパク質間相互作用 / シトクロムP450 / 酸化ストレス / 活性酸素種 / 小胞体 / 活性酸素 / 細胞ストレス |
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| Outline of Research at the Start |
身体の中には、薬のような本来体内には存在しない物質を分解し、体外に出す解毒のメカニズムが備わっている。その中心を担うのが肝臓に多く含まれる、薬物代謝酵素とよばれるタンパク質である。一方で、この解毒の仕組みには、がんなどの病気や老化の原因となる細胞内ストレスを引き起こす危険性も含まれる。本研究では薬物代謝酵素が互いに結合し、協力することで、その安全装置として働く可能性について検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、薬物代謝酵素シトクロムP450 (P450, CYP)とUDP-グルクロン酸転移酵素(UGT)のタンパク質間相互作用に関する研究に従事してきた。その中で、ヒト主要UGT分子種であるUGT2B7が、CYP3A4から産出される過酸化水素の量を減少させることを見出した (Miyauchi et al, Mol Pharmacol, 2015)。過酸化水素は有害な酸化ストレスを引き起こすことから、P450-UGT相互作用の生理学的な意義は、P450に起因する酸化ストレスの低減ではないかと仮定し、本研究でその解明を目指した。
P450－UGT相互作用の解析において重要になるのが共発現系の構築である。先行研究では、バキュロウイルス－昆虫細胞発現系を用いてP450とUGTを共発現させたが、より生体に近いモデルである哺乳動物細胞の方が、生理学的な意義の検討には適している。しかし、一般的な遺伝子導入方法である、トランスフェクション試薬を用いたプラスミドの導入だけでは、P450とUGTの発現レベルをコントロールすることが困難であった。そのため、新たな遺伝子導入方法として、哺乳動物細胞内で目的タンパク質の発現が可能な、baculovirus-mammalian cell expression system (bac-mam system)に着目し、アフリカミドリザルの腎由来細胞であるCOS-1細胞にCYP3A4を発現させる条件を検討した。最適化条件でウイルスを感染させ、調製したセルライセートにはCYP3A4活性が認められた。これは、薬物代謝酵素の研究におけるbac-mam systemの有用性を示すものであり、今後の研究への応用が期待される。
また、上記の研究から派生して、酸化ストレス誘導作用が報告されていた糖化産物ジヒドロピラジンの毒性発現機構も検討し、成果を論文として発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画とは異なるものの、bac-mam systemを用いたCYP3A4発現系の構築と、糖化産物ジヒドロピラジンの毒性発現機構について、論文として発表することができた。さらに、P450-UGT相互作用について、招待総説を執筆するなど、多くの実績を残すことができた。
一方、哺乳動物細胞を用いた別の発現系として、ドキシサイクリンにより発現制御が可能なTet-One systemに着目し、P450およびUGT遺伝子のサブクローニングを計画した。この系で用いるプラスミドの調製には、より大きな培養スケールに対応できる遠心機が必要だったため、新たに購入したところ、世界的な感染症拡大の影響に加え、欧州の動乱の影響により納品が年度末になってしまった。これによりサブクローニングが思うように進まず、コンストラクトの完成には至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
遠心機の納品遅延により、Tet-One systemを用いた薬物代謝酵素発現系の構築は、予定通りには進まなかった。研究期間を延長し、サブクローニングを完了するところまでは進めたいと考えている。また、本研究で構築したbac-mam systemをプラスミドのトランスフェクションと組合せることで、P450とUGTの遺伝子を別々の手法で培養細胞に導入することが可能になった。今後、P450-UGT相互作用の研究を発展させるためにも、この組み合わせによりP450とUGTの発現量のコントロールが可能かどうか、検討を続けたい。
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Report
(2 results)
Research Products
(14 results)
