| Project/Area Number |
20K16369
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 50010:Tumor biology-related
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| Research Institution | University of Occupational and Environmental Health, Japan |
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Principal Investigator |
原田 大史 産業医科大学, 医学部, 講師 (10835820)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2022: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000)
Fiscal Year 2021: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
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| Keywords | 低酸素培養 / 無血清培養 / 分化転換 / 細胞の分化転換 / がん微小環境 / 培養細胞の確保 / 初代・継代培養 / 研究機器の修理 / オートファジー |
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| Outline of Research at the Start |
がんを含む腫瘍細胞の分化転換（性質変化や形態変化）に多くの遺伝子発現の変化が関わることは、数多の知見で証明されてきました。一方で、がん細胞周囲の環境である「微小環境」が分化転換に関わるメカニズムはまだ明らかにされていません。
腫瘍細胞が生体内に発生する起源やその性質変化に、微小環境が深く関わっていることを証明するための研究を行っています。具体的には、研究で使用する培養細胞の酸素濃度や栄養を減らすなど「細胞の微小環境」を操作し、さらに薬剤で細胞を刺激して性質変化を効率的に起こす研究になります。がん細胞が薬剤耐性を獲得する、等の性質変化を起こす際に細胞の環境が深く関与することを明らかにします。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト子宮平滑筋腫の細胞を採取して、初代・継代培養して研究に使用するための細胞を増殖した。プライマリの培養細胞のため細胞を増殖した。次の実験段階として低酸素培養と無血清培養を併用し、βカテニン阻害剤あるいはROCK阻害剤などの蛋白阻害剤を併用することで分化転換を起こす過程が必要であり、分化転換に必要な培養液や実験に使用する消耗品を購入した。培養細胞にがん微小環境を模した細胞環境（低酸素・無血清）を用意し、更に分化転換に必要な方向性を（特定の蛋白阻害剤を利用して）示し、細胞の性質変化・形態変化を起こした。
培養細胞の分化転換を示唆する形態変化や蛋白発現の変化・オートファジーの活性化については確認できているが、上記の性質の変化に併せて細胞内の遺伝子発現の変化や電子顕微鏡を利用した細胞内環境の変化についてさらに立証する必要がある。
がん微小環境を利用した細胞の分化転換後の形態変化を確認し、分化転換した細胞の解析を行う過程にある。細胞骨格蛋白の変化を視覚的に証明し、平滑筋の骨格蛋白の減弱や神経細胞関連蛋白の発現をこれまでに確認した。
免疫染色による蛋白の変化の確認を行ったが、リアルタイムPCRや次世代型シーケンサーを利用した遺伝子変化の確認を行う前に、形態学的な変化の立証に重きを置いている現況がある。電子顕微鏡による解析はその一つである。
がん微小環境の機能との関連についても検討が必要だが、変化後の細胞に関して、細胞の形態変化（細胞骨格蛋白の変化を視覚的に証明）・免疫染色による蛋白の変化の確認・リアルタイムPCRや次世代型シーケンサーを利用した遺伝子変化の確認を連動して、性質変化の証明を行うことになる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
前年に引き続き培養器の不具合等もあり、この点は進捗に影響している。また神経細胞様の形態変化を起こした際に、細胞接着性が低い状態を意図的に準備（蛋白阻害剤を使用して操作）する必要があり、細胞が剥離しやすいことから形態学的な変化を起こしたときにこれを観測する方法に難渋している。電子顕微鏡等を利用する方法を検討しているが、これも繊細な操作過程が必要である（洗浄過程で容易に細胞が剥離する）ことから、細胞実験の手技をより繊細にしながら客観的評価が可能な結果を出すことを目指している。
研究室の人的資源が働き方改革等の影響で減少した影響があり、培養実験・研究を行う研究室全体の運用に関する課題が生じた。公的研究費を正しくかつ効率良く使用するために、研究費の使用についてはこれまでと同様に注意深く対応した。
研究結果の創出に際して、色々な細胞や培養器の個性に合わせて、分化転換を起こすために適正な細胞環境や実験手技を調整する必要があり、予定していた流れから遅れている現状がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
神経細胞様の形態変化について、電子顕微鏡を利用した確認をすることで、細胞内の電顕レベルの変化について観測を予定している。軸索のような細胞突起の伸長について、その内部構造を確認することを予定している。
電顕を利用して細胞変化について確認後に、研究成果の発表を検討している。延長を申請させて頂き、私自身が呈示した研究内容を証明し達成すること、研究費を正しく使用すること、この２点を主眼において研究を継続する。
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