軸索に着目した筋萎縮性側索硬化症の運動ニューロン選択的変性に関わる新規因子の探索
Project/Area Number |
20K16593
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Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Basic Section 52020:Neurology-related
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Research Institution | Tohoku University |
Principal Investigator |
光澤 志緒 東北大学, 医学系研究科, 大学院非常勤講師 (60869618)
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Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2021: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2020: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
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Keywords | 筋萎縮性側索硬化症 / TARDBP / TDP-43 / iPS細胞 / 運動ニューロン脆弱性 / PHOX2B / TAR-DNA binding protein / 人工多能性幹細胞 / 運動ニューロン / 軸索 |
Outline of Research at the Start |
本研究では、なぜ筋萎縮性側索硬化症(ALS)では運動ニューロンが選択的に変性するのかを、その解剖学的な特徴である長大な軸索に着目して解析する。申請者はALS患者の人工多能性幹細胞(iPS細胞)を樹立し、分化誘導した変異運動ニューロンの突起伸長が抑制されることを確認した。さらに、RNAシークエンスより変異運動ニューロン軸索で発現が低下している新規病態関連因子を見出した。今回は、その因子がゼブラフィッシュなどの動物モデルにおいても神経突起や運動機能に影響するかを確認し、さらにマイクロアレイによる下流経路の解析により、どのように神経突起伸長抑制や運動ニューロン変性を来すかを解析する。
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Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の運動ニューロン選択的変性の原因解明を目標に、その解剖学的な特徴である長大な軸索に着目し、運動ニューロン選択的変性について解析する。 ALSの原因遺伝子のひとつであるTARDBPはTDP-43をコードし、TDP-43はほとんどのALS患者の運動ニューロンの細胞体に異常凝集する重要な病態関連分子である。昨年度までに、TARDBP変異ALS患者の人工多能性幹細胞(iPS細胞)を樹立し、分化誘導した変異運動ニューロンの突起伸長が抑制されることを確認した。さらに、RNAシークエンスにより変異運動ニューロン軸索で発現が低下している新規病態関連因子PHOX2Bを見出し、その発現抑制で健常者運動ニューロンやゼブラフィッシュ脊髄軸索の伸長抑制が再現された。PHOX2Bは、ALSで発症後長期まで保たれる動眼神経や自律神経において発現が高いことから、変異運動ニューロンの選択的変性に関わる可能性が考えられた。さらなる研究として、PHOX2Bの下流に位置する標的因子の同定を目的としたPHOX2B発現抑制神経細胞のRNAシークエンスを行ったが、優位な変動を示す遺伝子群は検出されなかった。運動ニューロン内ではPHOX2Bは厳格に制御されていることが示唆された。 本年度は、外的介入によらないPHOX2Bの下流標的の解析として、PHOX2Bを多く含む自律神経などと運動ニューロンとのRNA比較解析を行うこととした。既報告を基に、健常者由来iPS細胞とALS患者TARDBP変異を導入したアイソジェニックラインiPS細胞を自律神経ニューロンへ分化誘導し、各種マーカーの発現を免疫細胞化学等で確認した。また、iPS細胞由来自律神経ニューロンのRNAシークエンスを実施した。 次年度は、RNAシークエンスの解析からPHOX2B下流標的遺伝子の同定、RNAやタンパク発現などの評価を行う。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
申請書内の実験計画である、「3.1 ヒトiPS細胞アイソジェニックラインを用いた新規病態関連因子X(=PHOX2B)の再現性の確認」、「3.2 in vitroでの新規病態関連因子X(=PHOX2B)の過剰発現実験」、「3.3 in vivoでの新規病態関連因子X(=PHOX2B)の過剰発現・発現抑制実験」のすべての計画を、昨年度までに実施、評価を行い、結果の一部をオープンアクセス誌Stem Cell Reportsに報告した。iPS由来運動ニューロンにGFPタグ付きPHOX2B発現レンチウイルスベクターを感染させることで試みた過剰発現実験では、PHOX2B-GFP容量依存的に発現が上昇する一方で内因性のPHOX2Bの発現が減少しており、PHOX2B過剰発現実験は困難であった。 次に、PHOX2Bの下流標的因子を特定するために神経芽細胞腫由来細胞を用いたPHOX2B発現抑制細胞のRNAシークエンスを行ったが、優位な変動を示す遺伝子群は検出されなかった。ニューロン内ではPHOX2Bは厳格に制御されており、過剰発現や発現抑制実験のみではPHOX2Bの下流標的因子の特定は難しいと考え、本年度は、PHOX2Bを多く含みALSで発症後期まで保たれる自律神経と運動ニューロンとの比較で下流標的因子の候補を見出すこととした。既報告(Kirino, et al. Sci Rep. 2018)を基に微修正したプロトコールを用いて自律神経の分化誘導を行った。分化誘導効率は、誘導後細胞の免疫細胞化学、および上記既報告の著者らより分与いただいたPHOX2Bプロモーター下にeGFPを発現するレポーター細胞であるPHOX2B::eGFP細胞の誘導後のGFP陽性率により評価し、高い誘導効率を得た。iPS由来自律神経ニューロンを、運動ニューロンと同様に細胞体と軸索に分けてRNAシークエンスを実施した。
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Strategy for Future Research Activity |
今後は、PHOX2Bがどのように運動ニューロン変性を来すかの解明を目標に、転写因子PHOX2Bの下流の標的因子の同定を行い、下流標的因子への治療として介入可能性を検討したい。上述のように、昨年度は、患者iPS細胞をALS進行期にも比較的保たれる自律神経などへ分化誘導しRNAシークエンスを実施したため、本年度で自律神経と運動ニューロンとの間で発現パターンを比較検討することで、PHOX2Bの下流標的因子の検索を行う。 また、転写調節領域を特定し、レポーター・アッセイで発現調節を明らかにする。さらに、PHOX2Bと運動ニューロン脆弱性をつなぐPHOX2Bの下流標的因子が軸索でどのように働いているかを確認するために、Puromycinで新規翻訳タンパクを標識し、免疫沈降サンプルを用いたプロテオーム解析を実施する。翻訳量に差が出るタンパクおよびタンパク複合体を特定し、PHOX2Bの下流標的因子のタンパクレベルでの発現や働きを明らかにする。
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Report
(3 results)
Research Products
(8 results)
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[Journal Article] Reduced PHOX2B stability causes axonal growth impairment in motor neurons with TARDBP mutations2021
Author(s)
Mitsuzawa S, Suzuki N, Akiyama T, Ishikawa M, Sone T, Kawada J, Funayama R, Shirota M, Mitsuhashi H, Morimoto S, Ikeda K, Shijo T, Ohno A, Nakamura N, Ono H, Ono R, Osana S, Nakagawa T, Nishiyama A, Izumi R, Kaneda S, Ikeuchi Y, Nakayama K, Fujii T, Warita H, Okano H, Aoki M.
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Journal Title
Stem Cell Reports
Volume: 16
Issue: 6
Pages: 1527-1541
DOI
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Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] Axonal growth impairment in iPS-derived motor neurons with TARDBP mutations.2021
Author(s)
Shio Mitsuzawa, Suzuki, Akiyama, Ishikawa, Sone, Kawada, Funayama, Mitsuhashi, Nishiyama, Ikeda, Shijo, Nakamura, H. Ono, R. Ono, Izumi, Ohno, Nakagawa, Nakayama, Warita, Okano, Aok.
Organizer
62st Annual Meeting of the Japanese Society of Neurology
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[Presentation] Reduced PHOX2B stability causes axonal growth impairment in motor neurons with TARDBP mutations2021
Author(s)
Shio Mitsuzawa, Naoki Suzuki, Tetsuya Akiyama, Mitsuru Ishikawa, Takefumi Sone, Jiro Kawada, Hiroaki Mitsuhashi, Satoru Morimoto, Kensuke Ikeda, Tomomi Shijo, Akiyuki Ohno, Naoko Nakamura, Hiroya Ono, Risako Ono, Ayumi Nishiyama, Rumiko Izumi, Masaaki Kato, Hitoshi Warita, Hideyuki Okano, Masashi Aoki
Organizer
PACTALS 2021
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[Presentation] REDUCED PHOX2B STABILITY CAUSES AXONAL GROWTH IMPAIRMENT IN MOTOR NEURONS WITH ALS-LINKED TARDBP MUTATIONS2021
Author(s)
Shio Mitsuzawa, Suzuki, Akiyama, Ishikawa, Sone, Kawada, Funayama, Mitsuhashi, Morimoto, Ikeda, Shijo, Ohno, Nakamura, H. Ono, R. Ono, Nishiyama, Izumi, Kaneda, Ikeuchi, Nakayama, Fujii, Warita, Okano, Aoki.
Organizer
ISSCR Tokyo 2021
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[Presentation] Axonal growth impairment in motor neurons with TARDBP mutations were mediated by PHOX2B downregulation2021
Author(s)
Shio Mitsuzawa, Suzuki, Akiyama, Ishikawa, Sone, Kawada, Funayama, Shirota, Mitsuhashi, Morimoto, Ikeda, Shijo, Ohno, Nakamura, H. Ono, R. Ono, Osana, Nakagawa, Nishiyama, Izumi, Kaneda, Ikeuchi, Nakayama, Fujii, Kato, Warita, Okano, Aoki.
Organizer
32th international symposium on ALS/MND
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[Presentation] Axonal pathology in amyotrophic lateral sclerosis with TARDBP mutations.2020
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Shio Mitsuzawa, Naoki Suzuki, Tetsuya Akiyama, Mitsuru Ishikawa, Takefumi Sone, Jiro Kawada, Ryo Funayama, Hiroaki Mitsuhashi, Ayumi Nishiyama, Kensuke Ikeda, Tomomi Shijo, Naoko Nakamura, Hiroya Ono, Risako Ono, Rumiko Izumi, Tadashi Nakagawa, Keiko Nakayama, Hitoshi Warita, Hideyuki Okano, and Masashi Aoki
Organizer
第61回日本神経学会学術大会(61st Annual Meeting of the Japanese Society of Neurology)
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