エクソソームプロファイリングによるダウン症候群の肺高血圧症発症病態の解明

• Project/Area Number: 20K16854
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 杉辺 英世 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (30791595)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: ダウン症候群 / iPS細胞 / エクソソーム / 肺高血圧症

Outline of Research at the Start

先天性心疾患を有するダウン症候群患者では肺高血圧の進展が早い、ということは以前から知られていたが、21トリソミーを有する肺血管内皮あるいは平滑筋細胞がどのような機序で肺高血圧症の発症に関与するかについては、未だほとんど明らかになっていない。本研究では、ダウン症候群iPS細胞から得られた血管内皮・平滑筋細胞において分泌されるエクソソームに含まれるRNAやタンパクを網羅的に解析し、さらにその特徴が患者検体でも同様であるかを確認することによって、ダウン症候群における肺高血圧の発症に関わる新たな機序を解明し、新規治療法の開発につながる病態解明を行う。

Outline of Annual Research Achievements

我々の研究室で確立したダウン症候群患者iPS細胞と、Cre/loxP系を用いて、21番染色体トリソミーをダイソミーにコレクションしたラインを、isogenicラインとして実験に用いることとした。両者について、血管平滑筋細胞への分化誘導については、既報の方法 （Patsch et al. Nat Cell Biol.2015;17:994-1003）を用いて行い、血管内皮細胞への分化誘導についてはTakara MiraCell; iPS Cell to Endothelial Cell Differentiation Kitを用いて行った。これらの細胞をサブコンフルエントまで増殖させ、その後エクソソームフリーの無血清培地に交換し、24時間後に培養上清を回収した。エクソソームの回収については、超遠心を用いた方法で行った。回収したエクソソームについては、そのサイズ分布についてqNANOを用いたナノトラッキング解析にて確認した。また、CD63, Tsg101, Synteninなどのエクソソームマーカーをウエスタンブロットで確認した。これらのエクソソームからmiRNAを含むRNAの回収を行い、本学微生物病研究所内にある、遺伝情報研究センターに提出した。
また、得られたエクソソームパターンから、in vitroでの研究だけでなく、in vivoにおいても同様のエクソソームパターンが得られるかどうかの検証が必要と判断し、The Jackson laboratory より、ダウン症候群モデルマウスとしてTs1Cjeマウスの受精卵を購入し、偽妊娠マウスに導入、生仔を得た。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ダウン症候群iPS細胞から血管内皮細胞および血管平滑筋細胞の樹立を行った。両者とも純度95%以上の非常に純度の高い血管内皮細胞および平滑筋細胞が得られ、研究に供することが出来た。また、培地中から高い精度でエクソソーム分画を単離することが出来た。これらを、RNA-seq解析に用いて、ダウン症候群に特異的なエクソソームの発現パターンを明らかにすることが出来た。

Strategy for Future Research Activity

我々の研究室で有している、他のダウン症候群患者由来iPS細胞からも血管内皮細胞および平滑筋細胞を分化誘導し、同様の方法でエクソソーム分画を回収し、その発現プロファイルを得る。また、isogenicな修復ラインだけでなく、ダウン症候群患者と同じ方法で樹立した、健常児iPS細胞由来の血管内皮細胞および平滑筋細胞においても、エクソソーム発現プロファイルを得て、サンプル数を増やすことでこれまでの成果をより確実なものにしたい。また、ダウン症候群モデルマウスにおいても、同様のエクソソーム発現パターンが示されるのかどうかについて検証し、in vitroの実験系だけでなく、in vivoでの実験や、ヒト患者においても検証を行っていく。