Project/Area Number |
20K16854
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Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
杉辺 英世 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (30791595)
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Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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Keywords | ダウン症候群 / iPS細胞 / エクソソーム / 肺高血圧症 |
Outline of Research at the Start |
先天性心疾患を有するダウン症候群患者では肺高血圧の進展が早い、ということは以前から知られていたが、21トリソミーを有する肺血管内皮あるいは平滑筋細胞がどのような機序で肺高血圧症の発症に関与するかについては、未だほとんど明らかになっていない。本研究では、ダウン症候群iPS細胞から得られた血管内皮・平滑筋細胞において分泌されるエクソソームに含まれるRNAやタンパクを網羅的に解析し、さらにその特徴が患者検体でも同様であるかを確認することによって、ダウン症候群における肺高血圧の発症に関わる新たな機序を解明し、新規治療法の開発につながる病態解明を行う。
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Outline of Annual Research Achievements |
我々の研究室で確立したダウン症候群患者iPS細胞と、Cre/loxP系を用いて、21番染色体トリソミーをダイソミーにコレクションしたラインを、isogenicラインとして実験に用いることとした。両者について、血管平滑筋細胞への分化誘導については、既報の方法 (Patsch et al. Nat Cell Biol.2015;17:994-1003)を用いて行い、血管内皮細胞への分化誘導についてはTakara MiraCell; iPS Cell to Endothelial Cell Differentiation Kitを用いて行った。これらの細胞をサブコンフルエントまで増殖させ、その後エクソソームフリーの無血清培地に交換し、24時間後に培養上清を回収した。エクソソームの回収については、これまで多くの報告があるが、我々は超遠心を用いた方法で行った。回収したエクソソームについては、そのサイズ分布についてqNANOを用いたナノトラッキング解析にて確認した。また、CD63, Tsg101, Synteninなどのエクソソームマーカーをウエスタンブロットで確認した。これらのエクソソームからmiRNAを含むRNAの回収を行い、現在、その解析を本学微生物病研究所内にある、遺伝情報研究センターにて行っている。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
エクソソームの回収は行っており、そのクウォリティチェックも行っている。現在はエクソソーム内に含まれるsmall RNAやlong noncoding RNAについてのシークエンス解析を行っているところである。
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Strategy for Future Research Activity |
RNA-seq解析結果をもとに、ダウン症候群由来の血管内皮細胞や血管平滑筋細胞における、特徴的なエクソソームプロファイルについての同定を行う。同定されたmiRNAやlncRNAの機能解析を行い、ダウン症候群患者における肺高血圧や血管機能低下の病態にどのように関わっているのかについての機能解析実験を行っていく予定である。
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