カルモジュリノパチーの病態解明と核酸医薬を用いた新規治療法の開発

• Project/Area Number: 20K17116
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 53020:Cardiology-related
• Research Institution: National Cardiovascular Center Research Institute
• Principal Investigator: 山本 雄大 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 流動研究員 (10802762)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2021: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000); Fiscal Year 2020: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
• Keywords: カルモジュリン / 不整脈 / QT延長症候群 / カテコラミン誘発性心室頻拍 / iPS細胞 / イオンチャネル / アンチセンス

Outline of Research at the Start

近年、CALM遺伝子変異により若年発症の致死性不整脈疾患が引き起こされることが報告された。“カルモジュリノパチー”と総称される、新しい疾患概念であり、世界で 70症例ほどが報告されている。本研究では患者データを解析する臨床研究から、iPS細胞・マウスモデルまで用いた包括的アプローチにより、病態解明と新規治療法の開発を目指す。病態解明のため、データベースより患者を抽出、心電図等の解析を行う。患者由来iPS細胞モデルを用いて発症機序に関わる分子を同定する。マウスモデルを用いてCALM遺伝子変異が発生や各臓器に与える影響を解析する。新規治療法として、アンチセンス核酸による新規治療法の開発を行う。

Outline of Annual Research Achievements

vivoモデルの確立を目指しCALM遺伝子関連不整脈疾患モデルマウスの作成に取り組んだ。CALM2-E46K変異（カテコラミン誘発性心室頻拍モデル）、D134H変異（QT延長症候群モデル）のノックインマウス作成をCRISPR-Cas9システムを用いたゲノム編集により実施した。1度目の実施ではそれぞれ150個の受精卵を用いてエレクトロポレーションを行い、産子数はそれぞれE46K変異で0匹、D134H変異で3匹であった。この結果よりCALM2遺伝子は胚発生や個体発生に大きく影響していることが示唆された。使用する受精卵の数やssODN（一本鎖オリゴ）等に変更を加え、3度目の実施により、D134H変異、E46K変異ともに目的の点突然変異が存在するアレルを持ったマウスを得ることができた。今後は、得られたノックインマウスの交配をすすめるとともに、表現型の解析を行う予定である。
CALM2-N98S変異を持つ患者は運動負荷によりQT延長や失神を来す症例が複数報告されており、この臨床症状はKCNQ1がコードする緩徐活性型遅延整流性K電流（IKs）の異常を原因とするQT延長症候群１型（LQT1）と同様であることに着目し、患者由来iPS 細胞を用いた実験を行った。運動負荷を再現した実験（イソプロテレノール負荷）において活動電位持続時間の短縮率が健常人由来のコントロールと比較して優位に小さいことを明らかにした。これはパッチクランプ法におけるIKs電流の解析により、運動負荷等のβ刺激に対するIKsチャネルの反応が変異カルモジュリンによって障害されているためであると考えられる。また、N98S変異カルモジュリンはL型Caチャネル電流（IcaL）の不活性化を障害することが既に報告されているが、イソプロテレノール負荷時においても同様のIcaLの不活性化障害が引き起こされていることを明らかにした。

Research Products

• [Presentation] Preclinical Proof-of-Concept Study: Antisense-mediated Knockdown of CALM as a Therapeutic Strategy for Calmodulinopathy (2020)
  • Author(s): Yuta Yamamoto, Takeru Makiyama, Yoshiki Kondo, Yusuke Iriyama, Ryutarou Ishikawa, Yimin Wuriyanghai, Hirohiko Kohjitani, Sayako Hirose, Jingshan Gao, Asami Kashiwa, Huang Hai, Takanori Aizawa, Tomohiko Imamura, Taisuke Ishikawa, Yoshinori Yoshida, Seiko Ohno, Minoru Horie, Naomasa Makita, Takeshi Kimura
  • Organizer: ESC Congress 2020
  • Int'l Joint Research