The novel strategy for treating atherosclerosis by regulating endothelial microRNA

Research Project

Project/Area Number	20K17165
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 53020:Cardiology-related
Research Institution	Meiji University of Integrative Medicine
Principal Investigator	足立孝臣明治国際医療大学, 臨床医学講座, 准教授 (20637277)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	miR-335 / 血管内皮細胞 / 大動脈 / CHFR / 動脈硬化 / RNAシークエンシング / マイクロRNA
Outline of Research at the Start	動脈硬化は，虚血性心疾患や脳梗塞の原因となり，重要な健康問題である．申請者は，動脈硬化の標準薬であるスタチンが、血管内皮細胞microRNAを制御し，動脈硬化抑制に寄与すると仮説を立て，既に、miR-335がスタチンにより負に制御されることを明らかにしている．そこで本研究では，miR-335を負に制御することで，動脈硬化を抑止することを目的とする．これにより，スタチンによる血管内皮細胞microRNAの制御が，動脈硬化抑制に寄与することを証明し，かつ，血管内皮細胞microRNAを標的とした，動脈硬化に対する新しい核酸医療を開発することが期待される．
Outline of Annual Research Achievements	本研究は，動脈硬化モデルマウスにおいてmiR-335を負に制御することで動脈硬化を抑止することを目的とする．これを明らかにするため，今年度は、昨年度行ったものとは異なる動脈硬化モデルとして、4週間の高脂肪食に加え浸透圧ポンプを用いたアンギオテンシンⅡ皮下持続投与を行い動脈硬化を誘発し、昨年度と同様に評価した．また，血管内皮細胞を用いて，miR-335とターゲット遺伝子CHFRの直接的結合について解析した．申請者は，研究計画に則り，ApoE-KOおよびApoE/miR-335DKOマウスに対し，4週間の高脂肪食に加え，浸透圧ポンプを用いたアンギオテンシンⅡ皮下持続投与を行い，動脈硬化を誘発した．介入終了後，大動脈を単離しEn face Oil red O染色により，全大動脈での動脈硬化領域を定量化し比較したところ，ApoE/miR-335DKOマウス群において有意に動脈硬化が抑止されていることを発見した．また大動脈起始部および大動脈弁の組織学的評価をH＆E染色にて行い，ApoE/miR-335DKOマウス群において有意に動脈硬化が抑止されていることを確認した．加えて，動脈硬化巣の免疫蛍光染色により，平滑筋細胞およびマクロファージを染色し，動脈硬化巣の性状・構成細胞を比較した．加えて申請者は，昨年度に同定したmiR-335のターゲット遺伝子CHFRについて，3’UTRレポーターアッセイを行い，miR-335との直接的結合を証明した．これらにより，血管内皮細胞においてmiR-335によるNFκBの活性化機序を明らかにした．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 申請者は，本研究において最も重要な，miR-335 inhibitorによる動脈硬化改善効果の解析を行う予定で実験を進めていたが，これに必要な物品および人的資源が，新型コロナウイルス感染症の影響に伴い確保できず，満足に遂行できていない．これを遂行すべく1年間の延長を申請し受理されている．今年度中に迅速に計画を遂行する．この結果から、miR-335ノックアウトによる動脈硬化改善効果の有無を明らかにする。
Strategy for Future Research Activity	申請者は昨年度中に，miR-335のノックアウトマウスでの動脈硬化抑止効果を発見した。これを踏まえ，miR-335 inhibitorを用いて動脈硬化の抑止を図る． miR-335 inhibitorは，miR-335に対する相補鎖オリゴヌクレオチドである．これを血管内皮細胞特異的に輸送するため，研究協力者より供与される7C1 nanoparticleを用いてマウスに投与する．動脈硬化モデルとしては， 4週間の高脂肪食に加え，アンギオテンシンⅡ皮下持続投与を行う方法を採用する．治療介入は，週一回，尾静脈注射にてinhibitorの投与を行う．介入期間終了後，昨年度と同様に動脈硬化を評価する．これにより，血管内皮細胞特異的なmiR-335抑制環境における，動脈硬化改善効果の有無を明らかにする．加えて，動脈硬化巣の免疫蛍光染色により，平滑筋細胞およびマクロファージを染色し，動脈硬化巣の性状・構成細胞を比較する．