先天性腎尿崩症の治療法探索のためのアデニル酸シクラーゼとGsαの構造解析
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20K17245
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 53040:Nephrology-related
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
野村 莉紗 東京医科歯科大学, 高等研究院, 特任助教 (70868124)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | ADCY 9 / アデニル酸シクラーゼ / Gsα / cryo EM / クライオ電子顕微鏡 / ADCY6 / 腎性尿崩症 / 単粒子解析 / ADCY9 / アデニル酸シクラーゼ6 / 構造解析 / アデニル酸シクラーぜ / 先天性腎尿崩症 |
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| Outline of Research at the Start |
難治性疾患である先天性腎性尿崩症(NDI)は3~20L/日の排尿とそれに伴う水分摂取が必要で、恒久的な知的発達障害や腎障害を伴いうる難治疾患であるが治療法は確立されていない。NDIでは腎臓のバソプレシン受容体というGタンパク共とその下流シグナル 関連蛋白質が治療標的となりえる。我々はクライオ電子顕微鏡を用いて、これらのシグナル伝達に関わる蛋白質の中で、特にヒト由来アデニル酸シクラーゼ6型(hAC6)を中心とした分子機構を解析し、NDIの新たな治療薬の構造基盤を得ることを目指す。また、hACは、多くのホルモンや神経伝達物質の受容体の下流で働いており、様々な疾患の治療法の一助になると思われる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は腎臓の集合管主細胞におけるバソプレシン受容体（V2R)の下流で働くアデニル酸シクラーゼ（ADCY)の構造解析をすることで、難治性疾患である腎性尿崩症（NDI)の分子治療標的の探索することを目的として行った。V2Rと共役するADCYとしてはADCY3,ADCY6,ADCY9が候補として挙げられた。ADCY９に関しては2019年にbovineのADCY9の構造が
報告されており、その発現精製方法を踏襲してhuman ADCY３、ADCY６、ADCY9の発現精製を試みた。過去の報告などから、特にV2Rとシグナルの下流で働くもので最も寄与率が高いと思われるのはADCY6であった。そこでhuman ADCY6の発現精製を特に重点的に行った。
まずはhumanADCY6遺伝子を合成しpFastBac, pFastBacMam vectorに導入、bacmidを作成、Sf 9＋細胞を用いてバキュロウイルスを作成しそれぞれSf 9＋細胞やExpi293細胞を用いて発現をおこなった。まずは既報のbovine ADCY9を参考に、C末端側にEGFPやHisタグを入れたコンストを作成して発現精製をおこなった。しかし発現が悪かったため、N末端側にEGFPやタグを入れたもの、EGFPを抜いたもの、他の9種類の哺乳類のADCY6の合成遺伝子を作成したもの、human ADCY9とのキメラを作成したもの、200種類の脊椎動物のADCY6の配列のconsensus配列から作成したコンストラクトなどを使用して発現精製を試みたがいずれもうまくはいかなかった。
human ADCY3に関してもC末端側にEGFPやタグを入れたコンストラクトを作成し発現を試みたがうまくいかなかった。
human ADCY9に関しては発現精製ができたためGsαとの複合体を作成し構造解析と論文化を進めている段階である。
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Report
(4 results)
Research Products
(2 results)
