| Project/Area Number |
20K17409
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
川井 英嗣 東海大学, 医学部, 助教 (70749944)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2020: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
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| Keywords | KMT2A / CREBBP / KMT2D / SRPK1 / UTX / STK3 / B細胞リンパ腫 / p300/CBP / 合成致死 / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Research at the Start |
悪性リンパ腫の中で、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)は最も頻度が高く、再発した場合、薬剤耐性化をきたし難治性を示す。COMPASS複合体を構成要素の一つであるKMT2D変異、またCBPをコードするCREBBP変異はDLBCLおよび濾胞性リンパ腫(FL)で高頻度に認められるが、COMPASS-CBP複合体を標的とした治療薬の開発は全く進んでいない。
COMPASS-CBP複合体変異細胞に対する合成致死遺伝子を、CRISPR/Cas9を用いたスクリーニングにより同定し、合成致死遺伝子を標的とした特異的治療法を開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
COMPASS複合体を形成するKMT2Dに対する合成致死遺伝子を同定し、治療につなげることが本研究の目的である。悪性リンパ腫細胞株(SU-DHL-4、U2932)にcas9を発現させた後、各遺伝子のノックアウト細胞(KO)を作成した。CRISPR/Cas9系を利用し、19000以上の遺伝子を網羅するレンチウイルスライブラリーをKMT2A野生型およびKO型に感染させた。DNAを回収し、次世代シーケンサーを用いて解析し、リード数を比較した。
KMT2Dについては、RNAシーケンスの結果を合わせ、279遺伝子をピックアップした。阻害剤がある遺伝子を選び、阻害剤のIC50を比較した。さらに阻害剤でKMT2A野生型とKO型で差があった遺伝子にしぼり、sgRNAを作成し、KMT2A野生型およびKO型細胞に感染させ、増殖能を比較した。この実験で再現性があり、阻害剤の実験結果と同一であれば、合成致死遺伝子の可能性が高く、in vivoでの証明等、さらに実験を進める予定である。
CREBBPに関しては、KMT2A同様に次世代シーケンサーにてリード数の比較を行ったが、有意差のある遺伝子は抽出できていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
上記のように、阻害剤にて差のある遺伝子に関し、sgRNAを作成し、KMT2A野生型およびKO型細胞に感染させ、増殖能を比較した。KO型のみで増殖抑制が証明されることが期待されたが、残念ながら差のある遺伝子は見つからず、候補遺伝子を抽出できていないため。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、SU-DHL-4にKMT2A野生型およびKO型を感染させた細胞、U2932にCREBBP野生型およびKO型を感染させた細胞をすでに作成し、機能解析を終了している。上記CRISPR/Cas9系を利用した大規模スクリーニングがうまくいっていない可能性がある。液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)を使用し、KMT2A、U2932の野生型、KO型の細胞におけるリン酸化を網羅的に解析したい。KO型のみでリン酸化が亢進しているものは、治療標的となる可能性がある。
さらにRNAシーケンスの実施、CRISPR/Cas9系を利用したエピジェネティック遺伝子のみに絞った(100遺伝子程度)小規模スクリーニングを実施する予定である。これらを総合し、合成致死遺伝子となりうる遺伝子の抽出を行いたい。
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