| Project/Area Number |
20K17409
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
川井 英嗣 東海大学, 医学部, 助教 (70749944)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2020: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
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| Keywords | KMT2D / SRPK1 / UTX / STK3 / B細胞リンパ腫 / p300/CBP / 合成致死 / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Research at the Start |
悪性リンパ腫の中で、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)は最も頻度が高く、再発した場合、薬剤耐性化をきたし難治性を示す。COMPASS複合体を構成要素の一つであるKMT2D変異、またCBPをコードするCREBBP変異はDLBCLおよび濾胞性リンパ腫(FL)で高頻度に認められるが、COMPASS-CBP複合体を標的とした治療薬の開発は全く進んでいない。
COMPASS-CBP複合体変異細胞に対する合成致死遺伝子を、CRISPR/Cas9を用いたスクリーニングにより同定し、合成致死遺伝子を標的とした特異的治療法を開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
COMPASS複合体を形成するKMT2D、UTXに対する合成致死遺伝子を同定し、治療につなげることが本研究の目的である。悪性リンパ腫または多発性骨髄腫細胞株にcas9を発現させた後、各遺伝子のノックアウト細胞(KO)を作成した。CRISPR/Cas9系を利用し、19000以上の遺伝子を網羅するレンチウイルスライブラリーを野生型およびKO型に感染させた。DNAを回収し、次世代シーケンサーを用いて解析し、リード数を比較した。
KMT2Dについては、RNAシーケンスの結果を合わせ、279遺伝子をピックアップした。阻害剤がある遺伝子を選び、実際に阻害剤のIC50を比較した。KMT2D-WT型と、KO型において、阻害剤のIC50を比較し、SRPK1阻害剤で2群間で有意差がみられた。in vitroでの薬剤感受性、細胞増殖をみる実験から、SRPK1阻害剤を暴露させると、KMT2D-KO型でより効果が表れた。
次に、SRPK1の3種類のsgRNAを含むウイルス液をそれぞれ作成し、KMT2D-WT型と、KO型細胞にそれぞれ感染させた。KMT2D-KO型細胞では、WTと比較し、明らかに細胞増殖能が抑制された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
UTXについて、ある阻害剤が、UTX-WT型、UTX-KO型細胞で、感受性の違いを示していたが、sgRNAのウイルスを感染させる実験で、有意差を証明できず、中断となってしまった。
KMT2Dについて、上記のように実験を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
in vivoにおいて、Akalucを感染させたKMT2D-WT型、KMT2D-KO型の細胞を準備できており、NOGマウスに移植し、それぞれvehicle投与群、SRPK1阻害剤投与群に分け2週間の投与を行い、生存曲線、およびIVISによる腫瘍量の比較を行う。
一方、なぜSRPK1阻害剤がKMT2D-KO型に効果があるのか、メカニズム解析を進めたい。リン酸化マッピングを行い、キナーゼのリン酸化に違いがあるのかどうか解析したい。
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