Bioengineering of functional bladder substitute using tissue decellularization and autologous derived bladder cells
| Project/Area Number |
20K17552
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
出口 幸一 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (00747082)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 膀胱再生 / 組織工学 / 再生医療 / 細胞外マトリックス / 細胞培養 / 脱細胞化 / 組織脱細胞化 / ヒト膀胱上皮細胞培養 / 組織再生 / 再生膀胱組織 |
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| Outline of Research at the Start |
総排泄腔外反や神経因性膀胱における尿失禁や上部尿路障害をはじめとする膀胱機能障害は、患者の社会生活に著しい障害をきたす。腸管を利用した膀胱拡大術は、コンプライアンスが低下した膀胱機能障害に対する標準治療であるが、消化管粘膜が尿に曝露されることによる合併症はいまだ解決されていない。本研究では、この問題点を克服する新たな外科的治療法として、同所移植が可能な新規再生膀胱の開発を目的としている。これまでの管腔臓器再生研究の成果を発展させ、自己由来の培養細胞と膀胱由来の生体材料を段階的に組みあわせる。それによって、膀胱に特有の組織形態と機能を持った、再生膀胱組織を開発することを目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
われわれは、二分脊椎・神経因性膀胱・外傷・腫瘍等が原因で進行した膀胱機能不全に対する再生治療として、異種由来組織と自己由来細胞を組み合わせた生体 適合性の高い再生膀胱組織の開発を目指している。具体的には、異種組織由来細胞外マトリックスに自己（レシピエント）由来膀胱細胞を播種することで、組織を三次元的に再構築し、移植可能な人工膀胱組織片を作成することを目標としている。これまで、細胞外マトリックスの作成、ヒト尿路上皮細胞の培養、両者を組み合わせ て三次元膀胱組織を作成するプロトコールの確立を行なった。
1. 細胞外マトリックス上播種培養および細胞分化誘導:ブタ膀胱を規程のプロトコールで脱細胞化し、脱細胞化細胞外マトリックスを作成した。その内腔表層にヒト由来尿路上皮細胞を1 x 10^6 cells/cm2の細胞密度で播種し、既定培地(Keratinocyte serum free medium)で静置培養、増殖させた。1週間の増殖の後、上述の既定培地にウシ血清を加え5日間培養し、さらに培養液中カルシウムイオン濃度を上昇させ1週間培養を継続した。
2. 細胞外マトリックス上播種培養後の細胞成熟の評価:マトリックス上に作成した膀胱上皮の機能評価項目として膀胱に対するバリア機能を選択した。膀胱上皮は生体内に移植されると直ちにかつ恒常的に尿に曝露されるが、尿は膀胱上皮やその下層に存在する組織に対して傷害的に作用する。そのため、生体の膀胱組織は尿に対してtightなバリアを形成することが知られるが、人工的に作成した膀胱上皮でも同様のバリア機能を持つことが、移植後の膀胱機能および組織生着にとって重要であると考えられる。膀胱バリア機能の評価法としてFITCデキストランを使用した透過性試験を行い、尿路上皮播種前と比較し、有意にデキストランの透過を抑制し、形成した人工膀胱上皮の機能が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
膀胱組織の三次元的な再生には膀胱平滑筋層の再建が必要となるが、比較的簡便な組織工学的手法で膀胱平滑筋層を機能的に再建する方法を確立した報告はないため、われわれはマトリックスに細胞注入して動的培養を行い組織を作成する方法、および生体組織（特に腸管組織）を利用する方法を検討した。
マトリックスに均一に細胞（平滑筋細胞や線維芽細胞等）を播種する方法を検討したが、菲薄化した膀胱由来細胞外マトリックスにシリンジ注射によって安定的かつ均一に細胞を播種することは非常に困難であった。本法の実現には、さらに高精度なマイクロポンプ等を用いた技術の確立が必要と判断し、本計画では行わない方針とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 膀胱平滑筋層の作成:臨床的に用いられている消化管を用いた膀胱拡大術を変更・応用する。消化管(主に小腸)の内腔を開き、小腸上皮を剥離後、膀胱上皮を播種した細胞外マトリックスを上皮を剥離した小腸組織(腸管膜が付着した状態)に縫着する。より少ない作業工程で膀胱組織を作成でき、臨床応用も容易であると考えられる。
2. 作成した膀胱上皮・細胞外マトリックス複合組織の機能評価:膀胱上皮の成熟度を評価する。これまで行った透過性試験に加えて、電気生理学的手法を用いたbarrier機能の評価を行う予定である。
3. 膀胱組織の移植:作成した膀胱組織を、小動物モデル膀胱に移植し、生着しうるか評価する。
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Report
(4 results)
Research Products
(5 results)
