| Project/Area Number |
20K17927
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 56010:Neurosurgery-related
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| Research Institution | Aichi Children’s Health and Medical Center (2022-2023)
Nagoya University (2020-2021) |
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Principal Investigator |
栗本 路弘 あいち小児保健医療総合センター(臨床研究室), 臨床研究室, 主任研究員 (40806501)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2020: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
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| Keywords | ゲノム解析 / 小児脳腫瘍 / リキッドバイオプシー / 脳腫瘍 / IDH / TERT / SNP / IDH1 |
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| Outline of Research at the Start |
血液検体由来のDNAに対するサンガーシークエンスを併用し、脳腫瘍の病型診断に必要な情報を網羅する。これらすべてに同じ腫瘍組織における通常シークエンスの結果を照合、また実際に術中解析を施行し病理診断と合わせて検証する。さらに診断的価値が高い遺伝子変異に対して強制発現細胞株を樹立し、条件検討を行った後に迅速診断技術を開発する。同時にナノワイヤでの髄液あるいは尿からのリキッドバイオプシー検体からDNA採取をし、遺伝子変異の検出を行う。以上の解析を組み合わせて脳腫瘍における超短時間オールインワン術中遺伝子変異診断技術の完成とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝子異常に基づく神経膠腫の病型分類に必要な遺伝子変異を術中に極めて短い時間でまとめて診断する技術を継続開発した。 TERT、BRAFに対してもプローブ開発を行い、多数の原発性脳腫瘍に対応できる術中オールインワン診断システムを構築し臨床応用を開始した。
これらの遺伝子変異の解析をすすめるため、利用可能な細胞株を検索し過剰発現細胞株を作成、強制発現プラスミドベクターを作成した。蛍光プローブであるQプローブを用いて、全自動 SNPs 解析装置 i-densyで解析した。上記解析の対象となった同一腫瘍組織の残検体を用いて、同定された異常があることをアンプリコンシークエンスにて変異を同定し比較対象とし、QIAamp DNAMini Kit (QIAGEN)を使用して腫瘍からDNAを採取、対象遺伝子および各染色体のhetero DNAに対して作成した Not Ⅰ配列付きプライマーを用いたPCRを行い対象領域のアンプリコンを作成、アンプリコンを Not Ⅰにてdigestion した後、T4 ligase にてligation を行うことにより長鎖 DNAを作成し、次世代シークエンサー用のアダプター配列をligationしHiseq 2500でシークエンスを行うことで、1%までの低アレル頻度の変異を高い正確性をもって判断することができた。染色体コピー数異常についてはさらに正確性を高めるため MLPA法を用いて再解析を行った。また髄芽腫および悪性リンパ腫が疑われる患者に対し、上記で確立した技術を用いて摘出検体に対する遺伝子変異の術中迅速診断を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
新興感染症流行および担当者の転勤により進行に多大な影響が出ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、術前病理診断と術後確定病理診断とも比較し迅速遺伝子診断の有用性を評価する予定である。また、悪性リンパ腫に対しての迅速解析研究を中心にリキッドバイオプシー技術の確立を進めていく予定。
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