| Project/Area Number |
20K18330
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 56050:Otorhinolaryngology-related
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| Research Institution | Institute for Clinical Research, National Hospital Organization Tochigi Hospital (2023)
独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター) (2020-2022) |
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Principal Investigator |
小島 敬史 独立行政法人国立病院機構栃木医療センター(臨床研究部), NHO栃木医療センター, 耳鼻咽喉科医長 (60528660)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | 先天性難聴 / 遺伝性難聴 / KCNQ4 / カリウムチャネル / 細胞毒性 |
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| Outline of Research at the Start |
KCNQ4遺伝子変異は、優性遺伝形式を取る非症候性感音性難聴 DFNA2の原因となる。主として後天発症の進行性難聴を呈し、 病原性メカニズムとしてチャネル機能異常が考えられている。これまでに40以上のKCNQ4変異が報告されているが、治療法は確立されていない。本研究ではKCNQ4変異の直接的毒性による細胞死という病因と、チャネル機能異常による静止膜電位の変化を効率よく観測できる実験系を樹立し、臨床情報と合わせて総合的に検討することで遺伝子型と表現型の関連性を明らかにしたい。さらに同系を応用し、聴力の回復もしくは難聴進行予防に有効な薬剤を発見するための高速スクリーニングを行いたい。
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| Outline of Annual Research Achievements |
先天性難聴は出生児1000人に1人の割合で発症し先天性疾患の中で最も高頻度に発生する疾患の一つで、半数以上は遺伝子変異に起因する遺伝性難聴であるとさ れる。原因遺伝子の同定、解析は世界中で進められ、新たな遺伝性難聴の可能性がある原因遺伝子・変異が続々と報告されている。しかし、これらはデータベー スから統計学的に算出されたもので基礎生物学的裏付けを欠いている物が非常に多く、効率的な変異蛋白機能評価法の開発が急務とされている。 KCNQ4遺伝子は常染色体優性遺伝形式を取る非症候性感音難聴DFNA2の原因遺伝子である。同遺伝形式の難聴では最も頻度が高い。加えてアジアで最も頻度の高い p.Q71fsは後天発症ながら進行性難聴により人工内耳導入が必要になる症例も散見され、KCNQ4遺伝子変異による難聴発症メカニズムの解析および治療法の同定は 社会的意義が高いと言える。
我々は本遺伝子の野生型と3種類の蛋白切断型変異について、HEK293T培養細胞Sleeping beauty transposon systemを用い、薬剤濃度依存性に目的蛋 白を誘導できる安定細胞株を樹立した。この細胞株を用い、電気生理学的検査、および経時的細胞死観測系を行った。本遺伝子のコードする蛋白質は外有毛細胞 底部に発現する電位依存性Kチャネルを形成し、病態として優性阻害効果もしくはハプロ不全によるチャネル機能不全が考えられていた。しかし、我々の実験に より、今回提示した3種のバリアントにおいてはチャネル機能不全ではなく、直接的細胞毒性によってアポトーシスが誘導されていることが病因である可能性を 示した。また、薬剤スクリーニングを行い、数種の薬剤がこの細胞毒性を和らげることを示した。以上の結果は国内外の学会で発表しており、Disease Models& Mechanismsオンラインジャーナルに掲載された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々は本遺伝子の野生型と、p.Q71fs、p.W242Xおよびp.A349fsの3種類の蛋白切断型変異に着目した。ヒト由来のHEK293T培養細胞とSleeping beauty transposon systemを用い、薬剤濃度依存性に目的蛋白を誘導できる安定細胞株を樹立した。電気生理学的検査では、野生型を誘導した細胞では静止膜電位の低下を認めたの に対し、短縮形バリアントでは静止膜電位の低下は認めなかった。ついで共免疫沈降検査を用い、野生型と短縮形バリアントでは複合体を形成しないことを示し た。さらに、プレーリーダーベースでリアルタイムに細胞死を観測した。結果として、野生型は細胞死を起こさないのに対し、短縮形バリアントでは誘導するタ ンパク量に応じた細胞死を呈した。また、この細胞死はアポトーシスに関連しているものであることを示した。加えて既存の薬剤ライブラリーを用い、この細胞 毒性を緩和できる可能性のある薬剤を探索した。上記の結果から、従来考えられていた優性阻害効果もしくはハプロ不全ではなく、直接的細胞毒性によってアポ トーシスが誘導されていることが病因である可能性を示した。また、薬剤スクリーニングを行い、数種の薬剤がこの細胞毒性を和らげることを示した。以上の結 果は国内外の学会で発表しており、2021年11月Disease Models & Mechanismsオンラインジャーナルに掲載された。
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| Strategy for Future Research Activity |
我々は先天性難聴の原因遺伝子であるKCNQ4のバリアントについて、高効率な変異蛋白機能計測、解析、薬剤スクリーニングを可能にするプレートリーダーベー スのアッセイ系の構築を目的とし、本研究を立ち上げた。 今回の実験により、我々はKCNQ4の特定の蛋白切断型変異が細胞毒性を示し、アポトーシスに関連した細胞死を呈し、特定の薬剤でその毒性が緩和されることを 示した。チャネルを構成する蛋白の遺伝子バリアントが、直接的細胞毒性による病態を示すという報告は無く、そのメカニズムは明らかになっていない。メカニ ズムとして、バリアントによる異常たんぱくの蓄積が推測され、このメカニズムの解析を行いたい。方法としてアポトーシスやERストレスに関連した既存遺伝子 をターゲットとしたqPCRによる解析を検討している。
また、東アジアで最も頻度の高いp.Q71fsについてはin vivoの系立ち上げのための予備実験を行いたい。
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