Project/Area Number |
20K18380
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Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Basic Section 56060:Ophthalmology-related
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
小林 礼子 大阪大学, 大学院医学系研究科, 特任助教(常勤) (10857874)
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Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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Keywords | ヒトiPS細胞の遺伝子組み換え / シングルセル蛍光イメージング / ヒトiPS細胞 / 眼発生 |
Outline of Research at the Start |
本研究課題では、ヒトiPS細胞から眼の各原基(網膜、水晶体、角膜など)を2次元で分化誘導できる培養法(SEAM法)を用いて、ヒトの初期の眼の発生や組織分化におけるRAX遺伝子の役割を解明することを目的としている。 将来的には、眼球の発生メカニズムや眼疾患の病態の解明、眼疾患の新規治療の開拓につながることが期待できる。
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Outline of Annual Research Achievements |
ヒトiPS細胞で眼の発生を模倣するSEAM法を基盤技術として、眼の発生初期に発現する転写因子RAX遺伝子の生理学的な機能を詳細に解明するために研究を行っている。 具体的には、RAX発現細胞を可視化してその細胞の挙動を追跡できるようなイメージングシステムの樹立、RAX遺伝子ノックアウト細胞の樹立、そしてそれらの細胞を用いて、RAX発現細胞と関連する眼発生ネットワークの解析を行うことを目標としている。 これまでにCRISPR/Casシステムを用いて、RAX遺伝子の発現に伴い蛍光蛋白質を発現する遺伝子組み換えヒトiPS細胞の樹立を試みていた。昨年度までのコンストラクトでは遺伝子組み換えを起こすことができなかったため、今年度はコンストラクトを変更し、新たな組み換え用ベクターとCas gRNAベクターを作製した。作製したベクターをヒトiPS細胞にトランスフェクションし、薬剤選択を行い、生き残った細胞のうち、蛍光蛋白質の発現しているクローンを複数取得した。得られたクローンのgenotypingを行ったところ、目的の遺伝子の場所に遺伝子導入できていることが確認できた。現在genotypingが終わっているクローンでは、遺伝子導入がホモあるいはヘテロで起こったことが確認できている。 今後はこれらのクローンを用いて、実験を進めていく予定である。また、今回遺伝子組み換えを行った際に、RAX遺伝子がノックアウトされた細胞も得られた可能性があるので、それを単離する予定としている。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
実験に用いる遺伝子組み換えiPS細胞の樹立がなかなか成功せず、これまで時間を要していたため。
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Strategy for Future Research Activity |
①得られた遺伝子組み換えiPS細胞を用いてSEAM形成を行い、眼の初期の発生においてその細胞がどのような挙動を示すのかをタイムラプス顕微鏡で継時的に観察していく。 ②①の遺伝子組み換え中に得られるRAX遺伝子ノックアウトヒトiPS細胞を単離し、SEAMの発生に与える影響を観察する。 ③SEAM形成初期におけるRAXやその他の眼の発生に関連する遺伝子の発現解析を行う。
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