| Project/Area Number |
20K19734
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 59040:Nutrition science and health science-related
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| Research Institution | Seinan Jo Gakuin University |
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Principal Investigator |
石井 愛子 西南女学院大学, 保健福祉学部, 助手 (40761325)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | 食物アレルギー / タイトジャンクション / 腸管上皮細胞 / バリア機能 / PDZRN3 |
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| Outline of Research at the Start |
腸管上皮細胞層におけるバリア機能の破綻は食物アレルギーなど様々な有害事象を引き起こす。そのバリア機能の要であるタイトジャンクション(TJ)の詳細な制御システムは不明な点が多い。申請者はこれまで、間葉系幹細胞の分化制御因子としてPDZRN3蛋白質の機能解析を行い、その過程でPDZRN3が腸管上皮細胞にも発現することを見出した。最近、他のTJ制御にPDZRN3が関わるという報告がなされたことから、PDZRN3が腸管上皮TJの機能制御に関わるのではないか？という着想を得た。本研究は、腸管バリア機能におけるPDZRN3の役割を調べ、食物アレルギーの治療及び予防薬開発に貢献しうる分子基盤の解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
腸管上皮細胞層におけるバリア機能の破綻は食物アレルギーなどの様々な有害事象を引き起こす。本研究では、バリア機能の要であるタイトジャンクション(TJ)の制御におけるPDZRN3の役割を明らかにすることを目的とする。昨年度までに、ヒト結腸腺癌由来細胞株Caco-2の単層形成モデルにおけるバリア機能の評価系を構築し、バリアの形成とPDZRN3の発現量が逆相関を示すことを見出した。また、単層形成過程ではバリアの主要な構成因子であるクローディン1の発現が誘導されるが、PDZRN3を過剰発現させると、クローディン1の発現量増加が抑制され、細胞間隙の密着性（経上皮電気抵抗値）が減少することを明らかとし、PDZRN3はTJの形成を負に制御している可能性を見出してきた。本年度は、PDZRN3とクローディン1の結合を調べるため、免疫沈降による解析を行った。クローディン1は膜タンパク質であるため、TritonX-100などの界面活性剤を用いて細胞を可溶化した際、適切な高次構造が壊れやすく、PDZRN3との相互作用に障害が起こり共沈降しない可能性が考えられる。そこで、細胞を可溶化する前に化学架橋試薬を作用させ、タンパク質間を共有結合させた後、PDZRN3と相互作用相手の結合が障害されない条件下において免疫沈降を行う。また、PDZRN3はユビキチンリガーゼ活性に重要なRINGドメイン、タンパク質間相互作用に関わるPDZドメイン（PDZ1とPDZ2）、PDZドメインに結合しうる結合モチーフを併せ持つ。タイトジャンクションに関係する全てのタンパク質について、PDZドメインやPDZ結合モチーフを持つものをリスト化し、これらについても順次調べていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は、PDZRN3とクローディン1の結合を調べるため、免疫沈降による解析を行った。クローディン1は膜タンパク質であり、TritonX-100などの界面活性剤を用いて細胞を可溶化した際、適切な高次構造が壊れやすく、PDZRN3との相互作用に障害が起こり共沈降しない可能性が考えられた。そのため、細胞を可溶化する前に化学架橋試薬を作用させ、タンパク質間を共有結合させた後、PDZRN3と相互作用相手の結合が障害されない条件を検討した。架橋試薬の濃度決定や反応時間、スペーサーアーム長（標識間の分子距離）設定の検討を行っているが、予想以上に時間を要した。さらに、研究代表者が異動のため研究環境の整備が必要となり、現在までの進捗状況を「やや遅れている」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度に引き続き、化学架橋試薬の条件検討を行う。また、PDZRN3はユビキチンリガーゼ活性に重要なRINGドメイン、タンパク質間相互作用に関わるPDZドメイン（PDZ1とPDZ2）、PDZドメインに結合しうる結合モチーフを併せ持つ。タイトジャンクションに関係する全てのタンパク質について、PDZドメインやPDZ結合モチーフを持つものをリスト化し、これらについても順次調べていく。
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