動物活動の定量計測と非線形時系列解析による、老化を支配する力学系システムの解明

• Project/Area Number: 20K20321
• Project/Area Number (Other): 18H05300 (2018-2019)
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2020); Single-year Grants (2018-2019)
• Review Section: Studies on the Super-Aging Society
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 荒田 幸信 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (40360482)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高木 拓明 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (10444514)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥25,350,000 (Direct Cost: ¥19,500,000、Indirect Cost: ¥5,850,000); Fiscal Year 2023: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2022: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2021: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2020: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2019: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2018: ¥8,060,000 (Direct Cost: ¥6,200,000、Indirect Cost: ¥1,860,000)
• Keywords: 線虫 / 老化 / 超長時間撮影 / 時系列解析 / ライフログ / 力学系 / 長時間計測 / 高時間分解計測 / Life-log / 超長時間計測 / 定量 / 寿命 / フラクタル / マイクロ流体デバイス / マイクロデバイス

Outline of Research at the Start

本研究では、顕微定量計測技術、マイクロ流体デバイス技術、画像解析技術を組み合わせ、線虫を個別のマイクロチャンバ内で飼育し、その活動を寿命時間（約一ヶ月間）に渡りビデオ撮影・計測する。さらに、得られた巨大な時系列を、非線形時系列解析及び力学系の理論を基礎に解析することにより、動物の寿命時間を決定するモデル（力学系の方程式）を決定する。この支配方程式を、個体システムの変数を外部から操作により検証する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、線虫の性成熟から死に至るまでの一生（約一ヶ月間）をビデオ撮影（5fps）し、動画から線虫の行動を計測することで、線虫の一生を支配する力学系システムを解明することである。本年度は、画像解析プログラムの精度を改善することで、線虫の運動が指数的に減衰する時期とほぼ変化しない時期があることを見つけた。我々ヒトの一生に、幼年期、青年期、中年期、老年期といったライフステージがあるように、線虫でも幾つかのライフステージ様の状態を遷移して死に至ることが明らかとなった（投稿準備中）。さらに、老化に伴う運動に指数減衰が現れたことから、その背後にはマルコフ的な体細胞ゲノム破壊があるという仮説、特にトランスポゾンによる体細胞ゲノム破壊の可能性に注目した。この仮説を検証するために、バイオインフォマティックス解析を行い、トランスポゾンの移動を仲介する135酵素遺伝子を同定した（投稿準備中）。これら135酵素遺伝子の内、10遺伝子は特にゲノム上に同じDNA配列をもつコピーが多数存在する遺伝子であった。これらの10遺伝子をfeeding RNAiによりノックダウンする準備を進めた。例えばTIR型DNAトランスポゾンの転移を仲介するトランスポゼース遺伝子(tpz)はtpz-10、tpz-139、tpz-150の３つだけで、94個のtpz遺伝子の約70%をノックダウンすることができる。また、レトロトランスポゾンの転移を仲介する逆転写酵素(rtz)については、18種類のsgRNAにより33遺伝子すべてをノックアウトすることができることがわかった。Cas9とsgRNAを発現する線虫株を構築し、ノックアウト株を樹立するためのスクリーニングを進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本課題で予定していた録画装置の開発については、要求性能を満たす装置を4台構築することができた。この4台の撮影装置で同時に2400匹の線虫の一生を録画することができる。撮影した動画はH265コーデックによりTIFFに比べデータを1000倍圧縮しても解析には支障がないことを確認した。この動画圧縮により、購入した100TBクラスのNASで動画データを十分に保存することができる。本課題予算で雇用した技術補佐員により、性成熟直後の線虫100匹を用意し撮影用プレートを作成する体制を構築し、効率的に撮影を進めることができている。まだ解析できていない録画も含めて、野生型、寿命変異体、RNAi線虫を合わせて現在までに、254録画（25400匹の線虫）を完了し、録画は現在も進行中である。本課題予算で共同研究を進めている客員研究員により画像解析アルゴリズムの開発と改良を効率的に進めることができている。動画の解析により、線虫の性成熟から死までに複数の定常状態と指数減衰過程があることを明らかにした。さらに、老化過程で指数減衰が現れることから背後にある分子メカニズムについての仮説を構築した。トランズポゾンによる体細胞ゲノムの破壊が個体システムの老化の原因であるとする仮説は古くから知られていたが、ゲノム上に存在するトランスポゾン遺伝子の数が多すぎることからこれまで実験で検証されることはなかった。独自のバイオインフォマティックス解析により、トランスポゾンの転移に関わる酵素遺伝子で活性を維持していると思われるコピーはわずか135コピーであることを明らかにした。これらの遺伝子をfeeding RNAi法でノックダウンすることにより仮説の検証を進めている。

Strategy for Future Research Activity

野生型15 plate（1500匹）の一生を録画した動画のさらに詳細な解析を進め、死に至るまでにライフステージがいくつ存在するのかを明らかにする。さらに、連続して1個体の一生の行動を追跡する画像解析プログラムを構築し、すべての個体がすべてのライフステージを遷移し死に至るのか、それとも途中のライフステージから死へ遷移する経路が存在するのかを明らかにする。さらに、寿命が変化する既存の遺伝子変異体で生死ダイナミクスの変化を明らかにし、遺伝子によるライフステージ遷移制御のメカニズムを明らかにする。さらに、トランスポゾンの転移を駆動する遺伝子で重複コピーの多い10遺伝子をfeeding RNAi法によりノックダウンした線虫の寿命を、ビデオ録画装置と画像解析プログラムで計測し、寿命と老化に与える影響を調べる。また、逆転写酵素33遺伝子のノックアウト株の樹立のためのスクリーニングを進める。このノックダウンまたはノックアウト実験により、トランスポゾンによる体細胞ゲノム破壊が線虫の老化の原因であるかどうかを明らかにする。

Research Products

• [Journal Article] Insulin signaling shapes fractal scaling of C. elegans behavior (2022)
  • Author(s): Arata Yukinobu、Shiga Itsuki、Ikeda Yusaku、Jurica Peter、Kimura Hiroshi、Kiyono Ken、Sako Yasushi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 10481-10481
  • DOI: 10.1038/s41598-022-13022-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Insulin signaling shapes fractal scaling of C. elegans benavior (2022)
  • Author(s): Yukinobu Arata, Itsuki Shiga, Yusaku Ikeda, Peter Jurica, Hiroshi Kimura, Ken Kiyono, Yasushi Sako
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: -
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] C. elegans episodic swimming is driven by multifractal kinetics (2020)
  • Author(s): Yusaku Ikeda, Peter Jurica, Hiroshi Kimura, Hiroaki Takagi, Zbigniew R. Struzik, Ken Kiyono, Yukinobu Arata & Yasushi Sako
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 1-17
  • DOI: 10.1038/s41598-020-70319-0
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] NEW FINDING OP50, a bacterial strain conventionally used as food for laboratory maintenance of C. elegans, is a biofilm formation defective mutant (2020)
  • Author(s): Yukinobu Arata, Taku Oshima, Yusaku Ikeda, Hiroshi Kimura and Yasushi Sako
  • Journal Title: microPublication Biology Volume: - Pages: 1-5
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 動物の老化研究における定量的アプローチ (2020)
  • Author(s): 荒田幸信
  • Journal Title: 月刊「細胞」 Volume: 52 Pages: 35-40
• [Journal Article] OP50, a bacterial strain conventionally used as food for laboratory maintenance of C. elegans, is a biofilm formation defective mutant (2020)
  • Author(s): Yukinobu Arata, Taku Oshima, Yusaku Ikeda, Hiroshi Kimura and Yasushi Sako
  • Journal Title: microPublication Biology Volume: 1 Pages: 1-5
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 1000匹以上の線虫の行動を一生の間ビデオ撮影するnemaLife-loggerにより同定した老化に伴う行動速度の指数減衰とトランスポゾン駆動老化仮説の実験検証 (2022)
  • Author(s): 荒田幸信
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] 動物の老化に伴う活動速度の指数減衰とトランスポゾン駆動老化仮説の検証 (2022)
  • Author(s): 荒田幸信
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Scale-free behaviors of C. elegans is shaped by Insulin signaling (2021)
  • Author(s): 荒田幸信
  • Organizer: 生物物理学会年会
• [Presentation] Life-logger, １０００匹の線虫の寿命時間スケールでの行動動態を計測するためのビデオ撮影装置の開発 (2020)
  • Author(s): 荒田幸信
  • Organizer: 生物物理学会年会