| Project/Area Number |
20K20566
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Review Section |
Medium-sized Section 37:Biomolecular chemistry and related fields
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
吉村 英哲 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (90464205)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥26,000,000 (Direct Cost: ¥20,000,000、Indirect Cost: ¥6,000,000)
Fiscal Year 2022: ¥7,800,000 (Direct Cost: ¥6,000,000、Indirect Cost: ¥1,800,000)
Fiscal Year 2021: ¥9,100,000 (Direct Cost: ¥7,000,000、Indirect Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2020: ¥9,100,000 (Direct Cost: ¥7,000,000、Indirect Cost: ¥2,100,000)
|
|---|
| Keywords | バイオイメージング / 生細胞 / 生物発光 / RNA / 顕微鏡 / 蛍光 / 多細胞 / 1細胞解析 / 遺伝子発現 |
|---|
| Outline of Research at the Start |
本研究では申請者独自の生細胞内RNA可視化技術と発光イメージング技術を基盤として、多細胞からなる生体試料を生かしたまま、構成する細胞内の遺伝子発現を経時的に可視化定量追跡する技術の創出を目的とする。具体的には、二分割ルシフェラーゼを用いた標的RNAの発光検出プローブの開発と、生きた生体試料を1細胞解像度で発光イメージングする顕微鏡開発を行う。生体サンプルを非破壊的に解析することで、従来法で同定された遺伝子の時空間プロファイルを解析する。従来法で得られた遺伝子発現情報を利用し、次に求められる遺伝子発現時空間プロファイルの情報を得ることを目指す。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
本申請研究は、生物発光イメージングを基盤とする技術を利用して、生きた細胞内において1細胞解像度での遺伝子発現定量解析技術を開発することを目的としている。すなわち、任意の生理現象（分化、リプログラミング、ガン化etc）が起こる前から完了するまでの全時間に渡って、標的遺伝子発現変化を1細胞解像度で経時追跡するための遺伝子発現可視化プローブ技術の構築を目指している。
2023年度はベータアクチンmRNAを原理実証の対象として、生物発光を利用した遺伝子発現産物すなわちmRNAの生細胞内可視化実験を行った。ベータアクチンmRNAの3'側に存在する非翻訳領域内の２箇所をプローブ結合箇所として選び、その領域に結合するRNA結合タンパク質PUM-HDの変異体mPUMを作成した。この変異mPUM２つに二分割NanoLuciferase（NLuc）断片を融合したプローブを作成した。このプローブは前年度までの実験で、試験管内における評価により、標的配列を有するRNAの添加と分解により、可逆的に発光地の増大と減少を示すことが確かめられている。このプローブをほ乳類培養細胞に導入し生物発光顕微鏡で観察したところ、細胞への刺激入力に伴いRNA顆粒を形成すること、およびその顆粒が細胞辺縁部へと集合していく様子が観察された。すなわちこの結果は、細胞生理現象の過程における遺伝子発現産物であるRNAの細胞内局在変化を継続して観察できたといえる。
以上のように本研究ではベータアクチンmRNAを原理実証の標的として、生物発光を利用した遺伝子発現産物の生細胞内可視化観察法を構築した。PUM-HD変異体の設計自由度から、本手法は様々な遺伝子発現産物の生物発光検出・可視化追跡法に応用可能であると期待できる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究において、申請時より開発目標の軸として定めていたターゲットは、生物発光を利用した生細胞内遺伝子発現プローブの開発であった。2023年度の研究によって、ベータアクチンmRNAを原理実証の標的とした生物発光プローブを開発し、生細胞内における遺伝子発現の生物発光による可視化観察を実現した。具体的には開発したプローブを生きたマウス由来線維芽細胞に導入し、成長因子刺激を細胞に加えた際の、細胞内のサブセルラー解像度での遺伝子発現産物、すなわちRNAの空間解析や経時変化の観察を実現した。この細胞内局在の経時変化解析は当初目的の中でも特に重視していたもので、従来の手法では、少なくとも内在性RNAを標的とした方法では、生物発光による可視化経時追跡は達成されていなかった。さらに本成果は、前年度までに行った試験管内におけるプローブの性能評価の結果と合わせてアメリカ化学会刊行の ACS Sensors に採択され掲載された。本プローブ開発に採用したmPUM技術は他の様々なRNAすなわち遺伝子発現産物にも応用可能であり、多くの生命現象について同様の解析を実現できると見込まれる。以上のような状況から、本申請研究はおおむね順調に進展しており、今後の発展についても期待できる成果が得られている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本研究では生物発光を利用した遺伝子発現産物のプローブを開発し、生細胞内での観察を実現した。続いての課題となる研究対象は、多細胞試料における遺伝子発現をサブセルラー解像度で観察し、細胞間の情報伝播に伴う遺伝子発現の変化を可視化解析することである。
そのため今後の研究では多細胞試料を一つの視野に捉え、サブセルラー解像度を保ちながら低倍率で生物発光顕微鏡観察を行うことで、多細胞試料における遺伝子発現１細胞可視化軌跡を行うことになる。またそのためのプローブ安定発現細胞株を構築する。この細胞をカバーガラス上で培養することで細胞シートを形成し、その細胞シート試料について長時間生物発光イメージングを行うことで、個々の細胞の動きや機能発現と連動した遺伝子発現プロファイルを１細胞解像度で可視化解析する。
また、多細胞試料は２次元細胞シートとは限らない。３次元細胞集団も試料として取り扱える方法の開発を目指す。具体的にはホログラフィックイメージング技術を採用し、生物発光プローブを発言した３次元多細胞試料に対してホログラフィック顕微鏡観察を行う。得られたホログラフィー像から生物発光シグナルの３次元構築を行い、遺伝子発現の時空間立体像を構築する。
これら技術開発を行うことで、生物発光遺伝子発現技術の応用範囲拡張を試みる。
|
