Novel design of AAV capsid by LassoGraft Technology

• Project/Area Number: 20K20581
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 高木 淳一 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (90212000)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥26,000,000 (Direct Cost: ¥20,000,000、Indirect Cost: ¥6,000,000); Fiscal Year 2023: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2022: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2021: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2020: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: アデノ随伴ウイルス / 環状ペプチド / ターゲッティング / 遺伝子治療

Outline of Research at the Start

アデノ随伴ウイルス（AAV）は遺伝子治療のベクターとしてもっとも期待されているが、望みの組織・細胞にだけ遺伝子を導入することが困難で、また導入効率自体も低いためウイルスの大量投与が必要である。本研究ではAAVのキャプシド蛋白質に特定の受容体に対する親和性を有する環状ペプチドの内部配列を埋め込むエンジニアリングを通して、遺伝子導入効率増大と細胞特異的なデリバリーを可能にすることを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、AAVのキャプシド蛋白質に特定の受容体に対する親和性を有する環状ペプチドの内部配列を埋め込むエンジニアリングを通して、遺伝子導入効率増大と細胞特異的なデリバリーを可能にすることを目指し、以下の2つの業務項目に従って研究を進めた。
（項目１）ペプチド提示型AAVによる感染トロピズム賦与の普遍性： 幹細胞のマーカーであり上皮細胞のラミニン受容体であるα6β1インテグリンとマクロファージの抑制性受容体であるSIRPαの２つに対する結合性環状ペプチド配列について、まずヒトIgG Fcにペプチドをグラフトした人工蛋白質をもちいてこれらの受容体に対する結合を調べたところ、前者についてはα6β1インテグリン強制発現細胞を、後者についてはマウスミクログリア細胞株MG6に対してそれぞれ強い結合が観察された。次にSIRPα結合ペプチドを提示するキメラAAVを作製し、MG6細胞への遺伝子導入を調べた結果、コントロールAAVに比べて数倍以上の導入効率の上昇が確認された。
（項目２）非分裂細胞に対するAAV感染・遺伝子導入能の飛躍的改善：非分裂細胞である神経細胞、筋細胞、肝細胞などに対するAAVの感染効率をブーストし、現状より遙かに低いタイターのウイルスで遺伝子導入を達成することを目指し、まず本年度はこれらの細胞に特異的に発現する受容体に対するペプチド配列の取得を行った。具体的には神経栄養因子BDNFの受容体であるTrkB、筋細胞でアセチルコリン受容体の集積に関わるMuSKキナーゼ、そして肝細胞増殖因子HGFの受容体Metならびに肝細胞表面のアシアロ糖蛋白質受容体（ASGR）に対する結合ペプチドを探索し、それぞれについて高親和性の環状ペプチドを単離し、しかもそれらが蛋白質表面にグラフト可能であることを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

項目１については、α6β1インテグリンを内因性に高発現する細胞株が入手できなかったため、SIRPα結合ペプチドについて主に取り組んだ。その結果、マウスミクログリア細胞株MG6においてSIRPα依存的な感染と遺伝子導入を達成した。よって目的である普遍性の確認は一定程度進んだと言える。ただし、オリジナルのAAVの感染能を破壊する戦略を採っているこの項目では、遺伝子導入の絶対的強度が野生型AAVに比して低く、将来の実用化に対して不安要素となっている。項目２については3種類の組織に存在する標的に対してペプチドの取得に成功し、しかもそれらのグラフト化まで達成した。この中のMet結合性ペプチドについてはすでにAAVへの組み込みとその感染能の評価も済ませ、予想通りの遺伝子導入能の増大まで確認した。以上のことから、「概ね順調な進展」と自己評価する。

Strategy for Future Research Activity

項目1については、野生型よりもトータルな感染能が落ちるという問題が顕在化したため、オリジナルのAAVの感染能を破壊する戦略を取ることは当面中断し、すべてのトライアルにおいて野生型の一部を変異体で置き換えたキメラAAVを利用する方針に変更する。この項目の主目的は本法の普遍性の確認であるので、項目2で得られた標的-ペプチドの組み合わせについての実験をこちらに移し、様々な受容体発現細胞への遺伝子導入の評価を中心にしていく予定である。項目2についてはまだAAVへのグラフトに進んでいないペプチドを順次すすめ、またマウス実験に供するためのAAVの大量調製法の確立に軸足を移していく。特に、最近えられたマウスMetに結合するペプチド配列を様々な血清型のAAVにグラフトし、最適なマウス実験のためのウイルスを同定する。

Research Products

• [Journal Article] tructural insights into the integrin α5β1 opening by fibronectin ligand. (2021)
  • Author(s): Schumacher S, Dedden D, Nunez RV, Matoba K, Takagi J, Biertumpfel C, Mizuno N.
  • Journal Title: Science Advances Volume: -
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Anti-USAG-1 therapy for tooth regeneration through enhanced BMP signaling (2021)
  • Author(s): Murashima-Suginami A.、Kiso H.、Tokita Y.、Mihara E.、Nambu Y.、Uozumi R.、Tabata Y.、Bessho K.、Takagi J.、Sugai M.、Takahashi K.
  • Journal Title: Science Advances Volume: 7 Issue: 7
  • DOI: 10.1126/sciadv.abf1798
  • NAID: 120006958083
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Lasso-grafting of macrocyclic peptide pharmacophores yields multi-functional proteins (2021)
  • Author(s): Mihara E, Watanabe S, Bashiruddin N, Nakamura N, Matoba K, Maini R, Yin Y, Sakai K, Arimori T, Matsumoto K, Suga H, and Takagi J.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 12 Issue: 1 Pages: 1543-1543
  • DOI: 10.1038/s41467-021-21875-0
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A feasibility study of inverse contrast-matching small-angle neutron scattering method combined with size exclusion chromatography using antibody interactions as model systems (2021)
  • Author(s): Sato Nobuhiro、Yogo Rina、Yanaka Saeko、Martel Anne、Porcar Lionel、Morishima Ken、Inoue Rintaro、Tominaga Taiki、Arimori Takao、Takagi Junichi、Sugiyama Masaaki、Kato Koichi
  • Journal Title: The Journal of Biochemistry Volume: 0 Issue: 6 Pages: 1-8
  • DOI: 10.1093/jb/mvab012
  • NAID: 40022687772
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural studies of reelin N-terminal region provides insights into a unique structural arrangement and functional multimerization (2020)
  • Author(s): Nagae Masamichi、Suzuki Kei、Yasui Norihisa、Nogi Terukazu、Kohno Takao、Hattori Mitsuharu、Takagi Junichi
  • Journal Title: The Journal of Biochemistry Volume: mvaa144 Issue: 5 Pages: 1-41
  • DOI: 10.1093/jb/mvaa144
  • NAID: 40022623693
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] High affinity modified ACE2 receptors protect from SARS-CoV-2 infection. (2020)
  • Author(s): Higuchi Y, Suzuki T, Arimori T, Ikemura N, Kirita Y, Ohgitani E, Mazda O, Motooka D, Nakamura S, Matsuura Y, Matoba S, Okamoto T, Takagi J, and Hoshino A.
  • Journal Title: bioRxiv Volume: -
  • DOI: 10.1101/2020.09.16.299891
  • Open Access
• [Journal Article] Development of cyclic peptides with potent in vivo osteogenic activity through RaPID-based affinity maturation (2020)
  • Author(s): Bashiruddin Nasir K.、Hayashi Mikihito、Nagano Masanobu、Wu Yan、Matsunaga Yukiko、Takagi Junichi、Nakashima Tomoki、Suga Hiroaki
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 117 Issue: 49 Pages: 31070-31077
  • DOI: 10.1073/pnas.2012266117
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Dissection of α 4 β 7 integrin regulation by Rap1 using novel conformation-specific monoclonal anti-β 7 antibodies. (2020)
  • Author(s): Sato T, Ishihara S, Marui R, Takagi J, Katagiri K
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 10 Issue: 1 Pages: 13221-13221
  • DOI: 10.1038/s41598-020-70111-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Negatively charged amino acids in the stalk region of membrane proteins reduce ectodomain shedding. (2020)
  • Author(s): Iwagishi R, Tanaka R, Seto M, Takagi T, Norioka N, Ueyama T, Kawamura T, Takagi J, Ogawa Y, Shirakabe K.
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 295 Issue: 35 Pages: 12343-12352
  • DOI: 10.1074/jbc.ra120.013758
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Site-specific epitope insertion into recombinant proteins using the MAP tag system. (2020)
  • Author(s): Wakasa A, Kaneko MK, Kato Y, Takagi J, and Arimori T.
  • Journal Title: The Journal of Biochemistry Volume: 168 Issue: 4 Pages: 375-384
  • DOI: 10.1093/jb/mvaa054
  • NAID: 40022393375
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Macrocyclic peptides that inhibit Wnt signallingviainteraction with Wnt3a (2020)
  • Author(s): Otero-Ramirez Manuel E.、Matoba Kyoko、Mihara Emiko、Passioura Toby、Takagi Junichi、Suga Hiroaki
  • Journal Title: RSC Chemical Biology Volume: 1 Issue: 1 Pages: 26-34
  • DOI: 10.1039/d0cb00016g
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] LassoGraft Technology による新規バイオ医薬品モダリティの創成 (2021)
  • Author(s): 高木 淳一
  • Organizer: 第114回未来医療セミナー（招待講演）
  • Invited
• [Presentation] Instant formulation of multispecific binders using LassoGraft Technology, (2021)
  • Author(s): Junichi Takagi
  • Organizer: PepTalk2021( Characterization of Biotherapeutics)
  • Int'l Joint Research / Invited