Expanded understanding of molecular mechanisms governing pluripotency by focusing on non-canonical translation.

• Project/Area Number: 20K20585
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 44:Biology at cellular to organismal levels, and related fields
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 高橋 和利 京都大学, iPS細胞研究所, 准教授 (80432326)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩崎 未央 京都大学, iPS細胞研究所, 講師 (10722811)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥25,610,000 (Direct Cost: ¥19,700,000、Indirect Cost: ¥5,910,000); Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000); Fiscal Year 2021: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000); Fiscal Year 2020: ¥13,520,000 (Direct Cost: ¥10,400,000、Indirect Cost: ¥3,120,000)
• Keywords: 翻訳 / 多能性幹細胞 / 非標準的翻訳 / 分化多能性 / リボソーム / プロテオミクス

Outline of Research at the Start

これまで翻訳されないと考えられてきた種類のRNAが実際は非標準的な機構で翻訳されていることに注目し、従来見過ごされてきた新規翻訳産物を同定することで現行タンパク質カタログを大幅に拡張する。これをもとに機能的スクリーニングを行い、ヒト分化多能性細胞をモデルとして、細胞の性質や運命決定機構を説明するにあたって「足りないもの」を探し出す。新しい分野の開拓により、真に細胞を理解することを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までに実施したCRISPR interference (CRISPRi) を用いた機能スクリーニングで、ヒト分化多能性幹細胞の自己複製 (生存・増殖) に必要な1800以上の遺伝子を同定した。本年度はスクリーニングでヒットした遺伝子の中から、非標準的翻訳に寄与していることが示唆されているEukaryotic translation initiation factor 3 subunit D (EIF3D) の機能解析を実施した。ドキシサイクリンの添加によりEIF3Dのノックダウンを誘導できるiPS細胞株を作製し、高効率に発現が抑制できることを確認した。ヒトiPS細胞におけるEIF3Dのノックダウンは形態の変化や細胞増殖の停止を引き起こした。遺伝子発現解析により、多能性幹細胞マーカーであるOCT3/4, SOX2, NANOGの低下やp53経路の活性化が見られた。リボソーマルプロファイリング法を用いて、EIF3Dをノックダウンした際の翻訳変化を調べたところ、約1300のmRNAにおいて翻訳量の有意な変化が確認できた。これらは多能性幹細胞の自己複製に重要であることが示されているシグナル伝達経路に属する遺伝子が有意に多く含んでおり、EIF3Dがパスウェイ単位で翻訳制御を行っている可能性が示唆された。また、p53はEIF3Dの直接の翻訳ターゲットではないが、EIF3Dがp53タンパク質の安定性を制御する因子群の翻訳を制御することにより間接的にp53の活性を制御していることを見出した。以上の結果から、翻訳因子EIF3Dが選択的な翻訳制御により分化多能性を維持するメカニズムが明らかとなった

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度までに得たデータを発展させ、良好な結果が得られた。

Strategy for Future Research Activity

本年度の研究成果により、非標準的な翻訳を担う因子が分化多能性の維持に必須であることを明らかにすることができた。このことは、本課題の研究対象である非標準的翻訳の重要性を示している。我々が実施した機能スクリーニングの結果は、EIF3D以外にも多くの翻訳制御因子が多能性幹細胞にとって重要であることを示唆している。そこで今後の展開として、他の翻訳因子の機能解析を実施し、非標準的な翻訳を包括的に理解することを目指したい。
さらに前年度から継続して検討している非標準的翻訳産物である低分子タンパク質の同定であるが、種々の検討により良好な結果が得られつつあるので、今後は質量分析を用いたタンパク質データを取得にも力を入れたい。

Research Products

• [Journal Article] Selective Translation Orchestrates Key Signaling Pathways in Primed Pluripotency (2024)
  • Author(s): Okubo Chikako、Nakamura Michiko、Sato Masae、Shichino Yuichi、Mito Mari、Takashima Yasuhiro、Iwasaki Shintaro、Takahashi Kazutoshi
  • Journal Title: bioRxiv Volume: 2024.02.09 Pages: 579580-579580
  • DOI: 10.1101/2024.02.09.579580
  • Open Access
• [Journal Article] Multi-omics approach reveals posttranscriptionally regulated genes are essential for human pluripotent stem cells (2022)
  • Author(s): Iwasaki Mio、Kawahara Yuka、Okubo Chikako、Yamakawa Tatsuya、Nakamura Michiko、Tabata Tsuyoshi、Nishi Yohei、Narita Megumi、Ohta Akira、Saito Hirohide、Yamamoto Takuya、Nakagawa Masato、Yamanaka Shinya、Takahashi Kazutoshi
  • Journal Title: iScience Volume: 25 Issue: 5 Pages: 104289-104289
  • DOI: 10.1016/j.isci.2022.104289
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A stress-reduced passaging technique improves the viability of human pluripotent cells. (2022)
  • Author(s): Takahashi, K., Okubo, C., Nakamura, M., Iwasaki, M., Kawahara, Y., Tabata, T., Miyamoto, Y., Woltjen, K., Yamanaka, S.
  • Journal Title: Cell Reports Methods Volume: 2 Issue: 2 Pages: 100155-100155
  • DOI: 10.1016/j.crmeth.2021.100155
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The pluripotent stem cell-specific transcript ESRG is dispensable for human pluripotency (2021)
  • Author(s): Takahashi Kazutoshi、Nakamura Michiko、Okubo Chikako、Kliesmete Zane、Ohnuki Mari、Narita Megumi、Watanabe Akira、Ueda Mai、Takashima Yasuhiro、Hellmann Ines、Yamanaka Shinya
  • Journal Title: PLOS Genetics Volume: 17 Issue: 5 Pages: 1009587-1009587
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1009587
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Dual inhibition of TMPRSS2 and Cathepsin B prevents SARS-CoV-2 infection in iPS cells. (2021)
  • Author(s): Hashimoto, R., Sakamoto, A., Deguchi, S., Yi, R., Sano, E., Hotta, A., Takahashi, K., Yamanaka, S., Takayama, K.
  • Journal Title: Molecular Therapy Nucleic Acids Volume: 26 Pages: 1107-1114
  • DOI: 10.1016/j.omtn.2021.10.016
  • NAID: 120007167315
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 分化多能性を規定する翻訳制御機構 (2023)
  • Author(s): 高橋和利
  • Organizer: 日本再生医療学会第3回科学シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 多能性幹細胞を規定する分子機構 (2023)
  • Author(s): 高橋和利
  • Organizer: 医学研究の最先端セミナー
  • Invited
• [Presentation] iPS細胞 (2023)
  • Author(s): 高橋和利
  • Organizer: 東京都医学総合研究所第3回都民講座
  • Invited
• [Presentation] Non-canonical mode of translation in pluripotency. (2022)
  • Author(s): 高橋 和利
  • Organizer: シングルセルゲノミクス研究会2022
  • Invited
• [Presentation] 細胞種依存的な翻訳制御因子NAT1の役割 (2021)
  • Author(s): 高橋和利
  • Organizer: 再生医療学会
  • Invited
• [Presentation] NAT1 is Required for Primed Pluripotency (2020)
  • Author(s): 高橋和利
  • Organizer: 分子生物学会年会
  • Invited