Microbial individual ecology based on cell isolation and observation

Research Project

Project/Area Number	20K21455
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 45:Biology at organismal to population levels and anthropology, and related fields
Research Institution	Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology
Principal Investigator	横川太一国立研究開発法人海洋研究開発機構, 超先鋭研究開発部門(超先鋭研究開発プログラム), 副主任研究員 (00402751)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	張翼国立研究開発法人海洋研究開発機構, 超先鋭研究開発部門(超先鋭研究プログラム), 副主任研究員 (40795358)
Project Period (FY)	2020-07-30 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2021: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000) Fiscal Year 2020: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Keywords	細菌個体隔離技術 / 細菌個体生態学 / 微生物生態学
Outline of Research at the Start	一般的に生態学では、ある生物の特徴を把握するために、「個体-個体群-群集」と異なるレベルで観察します。その結果からある生き物の生き様(生活史や、他の生物・環境との関わりかた）を理解します。しかし、単細胞生物を対象とする微生物生態学では、方法的制限により、個体・個体群を観察する術がありません。この結果、微生物生態学では、個体へアプローチできないことが、研究進展のボトルネックとなっています。本研究では、細菌懸濁液から一細菌個体(一細胞)ずつを隔離することができる「超微小液滴作製デバイス」を用いて、細菌群集内の個体に対して、性状測定を網羅的に実施することを目的とします。
Outline of Annual Research Achievements	本課題では、「細菌個体の生理活性ダイナミクスが、群集レベルでの機能に波及する機構」を明らかにするために、「細菌群集の中の個体(1細胞)の形質」の測定方法の確立を目的に研究を進めている。細菌個体隔離技術として、超微小液滴作製デバイス[フェムトリッター・ドロップレット・アレイ(Femtoliter droplet array, FemDA)]を使用した。これは、1cm角の薄板ガラスに微細加工技術を用いて30fLの容器を100万個整列したものである。令和3年度に実施した実験の結果から、培養株の個体性状測定では、1)細菌密度、2) 各個体の細胞サイズ、各個体が細胞膜結合型酵素の有無が増殖サイクル上での異なるステージ（遅滞期、対数増殖期、定常期、死滅期）において、個体間の形質にばらつきが生じることが明らかになった。令和4年度では、この個体性状測定における測定パラメータの追加およびデータ取得における高効率化に取り組んだ。観測の結果、細胞個体から離れて、遊離した状態でも機能する酵素群（細胞外酵素）の存在と、増殖サイクル上での変動が顕著であることがあ確認できたので、これを今後の取得する際の測定パラメータとして追加する。またデータ取得に関しては、デバイス上の液滴および液滴内の細胞認識、細胞性状および細胞外酵素活性データ取得を行う画像解析技術の構築を行った。この画像技術の構築により、本研究課題である対象培養株あるいは対象環境微生物群集中個体の細胞性状測定を正確・迅速に行うことが期待できる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 令和3年度と同様にコロナ禍の影響を受け、2点が原因となり研究の進捗が遅れている。1)使用する実験施設/機材の使用が制限された期間があったため。2)使用予定試薬消耗品の手配が困難であったため。
Strategy for Future Research Activity	令和5年度は「FemDAを用いて隔離した細菌細胞の性状測定のための、デバイス改良とデータ検証」とともに「デバイス上の液滴および液滴内の細胞認識、細胞性状データ取得を行う画像解析技術の構築」に取り組む。単離細菌培養株を使用したFemDAの測定として、1)各個体の核酸量、2)各個体の特性細胞膜結合型酵素活性、3)細胞外酵素活性を行う。隔離後の個体性状のデータ取得に際して、画像解析技術を構築し、データ取得のハイスループット化を進める。引き続き、観察対象である細菌の培養、環境細菌の採取、観察および生理測定等の微生物学的測定全般は研究代表者の横川が行う。FemDAの作成、液滴サイズの最適化、計測環境の構築、酵素活性測定のためのアッセイ系の構築は研究分担者である張が行う。また画像解析技術の構築には専門家のアドバイスを仰ぎながら研究代表者および分担者の2名で取り組む。手法確立に向けた全体の計画・実行・評価・改善は研究代表者と分担者が協力して行う。