Development of a fluorescent GABA probe for analysis of pathological mechanism in autism spectrum disorder
| Project/Area Number |
20K22699
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Review Section |
0704:Neuroscience, brain sciences, and related fields
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology |
|---|
Principal Investigator |
瀧川 健司 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 主任研究員 (60749274)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-09-11 – 2024-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
|
| Budget Amount *help |
¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
|
|---|
| Keywords | GABA / 蛍光プローブ / 自閉症スペクトラム障害 / イメージング |
|---|
| Outline of Research at the Start |
自閉症スペクトラム障害（ASD）の脳内では抑制性シナプスの機能不全が共通した表現型として認められ、ASD症状を引き起こす要因と示唆されている。本研究では、ASD病態における抑制性シナプスの機能不全はシナプス前部の機能変容に基づくと仮説を立てた。本仮説を検証するために、GABAの時空間動態を高精細に可視化する蛍光プローブを開発し、GABAイメージングを行うことで、ASD病態における抑制性シナプス前部の機能的特性を明らかにする。また、超解像顕微鏡による抑制性シナプス前部の分子の可視化解析を通して、ASD病態において抑制性シナプスが機能不全を起こす分子機構の解明を目指す。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、自閉症病態において抑制性シナプス前部のGABA放出機能にどのような変化が生じているのかを調べるために、神経細胞のシナプス前部から開口放出されるGABAを計測するGABA蛍光イメージング技術の確立を目指している。本年度は、本研究課題で開発したGABA蛍光プローブを細胞膜上にストレプトアビジン-ビオチンを介して固定することで、培養神経細胞や脳スライス標本において抑制性シナプスから細胞外に放出されるGABAを定量的に計測する手法の構築を試みた。この手法では、GABA蛍光プローブをビオチン化し、ストレプトアビジンと混合することでストレプトアビジンとGABA蛍光プローブの複合体を形成させ、ビオチン化した神経組織に複合体を添加することでGABA蛍光プローブを細胞膜上に固定する。ストレプトアビジン1分子あたりのGABA蛍光プローブの分子数を最大にし、GABA蛍光プローブを効率よく細胞膜上に固定するために、ストレプトアビジンとGABA蛍光プローブの混合比の異なる複数種類の複合体を、ビオチン化した非神経細胞の標本に個別に添加後、各細胞標本を蛍光顕微鏡で撮影し、蛍光画像の輝度値を比較した。その結果、細胞膜を最も明るく染色できる混合比を決定することができた。さらに、細胞膜上に固定したGABA蛍光プローブの性能を評価するために、GABA蛍光プローブを固定した細胞標本にGABAの終濃度が1 mM以上となるように高濃度のGABAを添加した。その結果、GABAの添加前後で蛍光強度が増加した。これらの結果から、GABA蛍光プローブは、細胞膜上に固定された環境下においてもGABAに対する応答性が維持されていることが明らかとなった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度に計画していたGABA蛍光イメージング技術の確立を順調に進めることができたため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本年度に構築したGABA蛍光プローブの細胞膜上への固定技術を培養神経細胞に適用し、抑制性シナプスから細胞外に放出されるGABAを観測する蛍光イメージングを試みる。また、GABA蛍光イメージング技術と超解像イメージング技術を組み合わせて、自閉症病態において抑制性シナプス前部の機能や分子の発現パターンにどのような変化が生じているのかを調べる。
|
Report
(3 results)
Research Products
(9 results)
-
-
-
[Journal Article] Real-time in vivo imaging of extracellular ATP in the brain with a hybrid-type fluorescent sensor2020
Author(s)
Kitajima N, Takikawa K, Sekiya H, Satoh K, Asanuma D, Sakamoto H, Takahashi S, Hanaoka K, Urano Y, Namiki S, Iino M, Hirose K
-
Journal Title
eLife
Volume: 9
Pages: 1-18
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
-
-
-
-
-
-
