| Project/Area Number |
20KK0152
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| Research Category |
Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
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| Research Institution | Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine |
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Principal Investigator |
西川 義文 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 教授 (90431395)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邉 謙一 帯広畜産大学, 畜産学部, 准教授 (10761702)
二瓶 浩一 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 研究員 (40373344)
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| Project Period (FY) |
2020-10-27 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,850,000 (Direct Cost: ¥14,500,000、Indirect Cost: ¥4,350,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2021: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 原虫 / トキソプラズマ / ワクチン / モンゴル / 小型反芻獣 |
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| Outline of Research at the Start |
モンゴルでの農牧業は主要産業の一つであるが様々な家畜感染症が発生しており、家畜の繁殖障害が常在化している。本研究ではモンゴルの重要な家畜資源である小型反芻獣に着目し、流産の発症に関与するトキソプラズマ感染に対する新しいワクチンの開発を目指す。モンゴル由来原虫株を分離し、細胞スクリーニング法による免疫刺激型抗原の同定、プロテオームによる自然感染動物で認識される感染認識抗原の同定を進め、これら抗原を組み合わせたカクテルワクチンの開発を進める。さらに、遺伝子破壊原虫の解析で新規ワクチン抗原の機能を理解し、小型反芻獣への感染実験を通じて新規ワクチンの効果と防御免疫反応の詳細を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
モンゴルの獣医学研究所（IVM）にて、ヒツジを用いたトキソプラズマ感染実験および３種混合DNAワクチン接種実験を実施した。
（１）ヒツジにおけるトキソプラズマ感染モデルの検証
帯広畜産大学原虫病研究センターからIVMへ原虫株を分与し、培養技術の導入を行った。2種類の原虫株（強毒株RH株、弱毒ME49株）を用いて、ヒツジへの感染実験（N=2/試験区）を行った。両試験区で感染後１週目での一過性の体温の上昇、感染後２週目からGRA14抗体の産生、感染後１ヶ月で体重減少が認められた。感染後２ヶ月で解剖し、組織中の原虫DNAを定量したところ、脳を含めた主要な臓器で原虫感染が認められた。
（２）３種混合DNAワクチン（TgGRA7, TgGRA14, TgGRA15）のワクチン効果の検証
ビタミンEと脂質ナノ粒子を使用した３種混合DNAワクチンの接種群（N=4）とコントロールDNA接種群（N=5）を設定し、妊娠したヒツジに対しME49株の攻撃試験を行った。本感染実験では、妊娠中期の原虫の攻撃感染により、流産、死産は認められなかった。分娩後は、授乳と子羊の健康状態はワクチン接種で良好な結果であった。ワクチン接種群ではTgGRA7, TgGRA14, TgGRA15に対する特異抗体の産生が認められた。母羊と子羊を解剖し、組織中の原虫DNAを定量したところ、DNAワクチン接種により母羊と子牛での原虫体内伝搬の抑制傾向が認められた。特に子羊の脳では有意に原虫伝搬が阻害されていたことから、３種混合DNAワクチンは原虫の垂直伝搬を阻止する可能性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
モンゴルの獣医学研究所（IVM）にて、ヒツジを用いた（１）トキソプラズマ感染実験および（２）３種混合DNAワクチン接種実験を実施した。以下に示すように、ヒツジの感染モデルにより新型DNAワクチンの有効性を確認できたため、おおむね順調に進展していると判断した。
（１）2種類の原虫株（強毒株RH株、弱毒ME49株）を用いて、ヒツジへの感染実験（N=2/試験区）を行った。両試験区で感染後１週目での一過性の体温の上昇、感染後２週目からGRA14抗体の産生、感染後１ヶ月で体重減少が認められた。感染後２ヶ月で解剖し、組織中の原虫DNAを定量したところ、脳を含めた主要な臓器で原虫感染が認められた。
（２）ビタミンEと脂質ナノ粒子を使用した３種混合DNAワクチン（TgGRA7, TgGRA14, TgGRA15）の接種群（N=4）とコントロールDNA接種群（N=5）を設定し、妊娠したヒツジに対しME49株の攻撃試験を行った。授乳と子羊の健康状態はワクチン接種で良好な結果であった。ワクチン接種群ではTgGRA7, TgGRA14, TgGRA15に対する特異抗体の産生が認められた。母羊と子羊を解剖し、組織中の原虫DNAを定量したところ、DNAワクチン接種により母羊と子牛での原虫体内伝搬の抑制傾向が認められた。特に子羊の脳では有意に原虫伝搬が阻害されていたことから、３種混合DNAワクチンは原虫の垂直伝搬を阻止する可能性が示された。
また、TLR2（Toll様受容体2）のアジュバントであるPam3CSK4がトキソプラズマ感染に対する防御反応を誘導することが明らかとなった。通常、防御免疫反応を誘導するためには抗原とアジュバントを併用して摂取する必要があるが、Pam3CSK4の単独投与で感染マウスの生存率の上昇と脳内原虫感染を抑制することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、３種混合DNAワクチン（TgGRA7, TgGRA14, TgGRA15）のワクチン効果の作用機序を検証する必要がある。そこで、マウス感染モデルにより脾臓をリンパ節の免疫細胞を分離して、細胞集団の解析を予定している。
また、Pam3CSK4が誘導するトキソプラズマ感染に対する防御反応の作用機序についても追加の解析が必要である。Pam3CSK4接種によるマウスでのトキソプラズマ感染に対する獲得免疫の誘導は確認できなかったため、自然免疫に着目する。マクロファージなどの抗原提示細胞にPam3CSK4を作用させ、原虫あるいは原虫抗原の有無で細胞反応の変化（サイトカイン産生や免疫関連分子のmRNA発現）を解析する。
従って、補助事業期間を延長し、上記研究課題を実施する。
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