| Project/Area Number |
20KK0366
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| Research Category |
Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (A))
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 46010:Neuroscience-general-related
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science (2023)
University of Yamanashi (2020-2022) |
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Principal Investigator |
篠崎 陽一 公益財団法人東京都医学総合研究所, 疾患制御研究分野, 副参事研究員 (10443772)
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| Project Period (FY) |
2021 – 2024
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000)
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| Keywords | グリア / 緑内障 / ミクログリア / 神経変性 / 網膜 / 1細胞RNAシークエンス / オートファジー / 細胞老化 / 一細胞解析 |
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| Outline of Research at the Start |
本国際共同研究は、グリア細胞の機能異常を起点とした緑内障発症メカニズムの解明を格段に発展させる事を目的とする。特にミクログリアの関与について解析を進めるため、１細胞RNAシークエンス及びバイオインフォマティクスを駆使してこの課題に取り組む。視覚組織の１細胞解析は全世界的に見ても限られた国、組織でしか達成されていないため、当該組織の取り扱いに習熟した研究グループである、英国ロンドン大学眼科研究所の大沼信一教授との国際共同研究を行い、UCLでい1細胞解析を行い、山梨大学でウェット実験を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2023年度は、ミクログリアのP2Y6受容体欠損による緑内障病態への影響を調べるため、ミクログリア特異的P2Y6受容体欠損マウスの作製を進めた。本目的のためにこれまで研究代表者が使用していたFASTシステムを用いることとした。つまり、P2ry6-tetOマウスを作出してIba1-tTSマウスと掛け合わせることによってミクログリア特異的にP2Y6受容体を欠損するシステム構築を進めた。現在P2ry6-tetOマウスは既に得られており、Iba1-tTSとの交配を行っている状況である。網膜におけるミクログリアP2Y6受容体の重要性を示すため、細胞レベルでの発現を検討した。公共データを用いたヒトP2RY6遺伝子の網膜1細胞RNA-seqやMACSによるマウス網膜からグリアや神経細胞分離とqPCRによる評価を行ったところ、ミクログリアにおいてP2Y6受容体発現が最も高かった。単離したミクログリアを内在性P2Y6受容体アゴニストUDPで刺激すると細胞内Ca2+上昇が認められ、P2Y6受容体が機能的に発現していることが明らかとなった。ミクログリア特異的P2Y6受容体ノックアウトマウス創出までの代替法として、研究代表者が開発したグリア細胞の経鼻的移植法(Parajuli et al. GLIA 2020)を用いてミクログリアを網膜へ移植することに成功した。本移植法を用いることによってミクログリアのみを野生型に入れ替えることができ、これに伴う視覚機能変化の評価を進めている。また、移植に伴う視覚機能改善を経日的に評価するために電気生理学的および行動学的な評価系の確立を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
視覚機能評価系としてVisual Cliff Test (VC)およびOptomotor Response (OMR)などの行動解析や、網膜電図(ERG)による暗順応後の微弱な光刺激に伴う上向き応答(positive scotopic threshold response, pSTR)を採用した。これまでP2Y6受容体欠損(P2Y6KO)マウスでは6ヶ月齢以上においてRGCの脱落が認められていた(Shinozaki et al. JCI Insight 2017)。これに対応するようにP2Y6KOマウスではVCにおいて安全な,または床が透明なエリアそれぞれの滞在時間がほぼ同等であった。つまり本マウスは深さ知覚が喪失していると考えられる。また、OMRでは野生型(WT)マウスは白黒の縞模様の視覚刺激に対して追随応答を示すが、P2Y6KOでは顕著に応答が減弱しており運動視野の感受性も減弱していることが明らかとなった。またERGでもWTマウスに比べて顕著に反応が減弱していたことから視覚入力に伴う網膜の電気的応答、特にRGCなど最内層の応答が低下していることが明らかとなった。ミクログリアの機能不全、特にP2Y6受容体欠損が視覚機能低下に関連することを示すため、以前開発した非侵襲的ミクログリア移植法を用いて網膜への移植を試みた。まずP2Y6KOマウスにColony Stimulating Factor 1 (CSF1)受容体拮抗薬 PLX5622を7日間経口投与して網膜ミクログリアの大部分を除去した後にWTミクログリアを経鼻移植すると、網膜に外来ミクログリアが生着することを発見した。
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| Strategy for Future Research Activity |
P2Y6KOマウスにWTミクログリアを移植することによる視覚機能の改善効果をVC, OMR, ERGを用いて評価する。脳では外来ミクログリアは少なくとも４週間程度は維持されることは確認しており、網膜内にどの程度維持されるかについても検討を進める。また、網膜だけでなく視神経乳頭部についても解析を進める予定である。ミクログリアは視神経周囲にも高密度に存在しており、ミクログリアマーカーやP2ry6遺伝子発現は網膜よりも視神経乳頭部のほうが顕著に高い。ヒト緑内障患者、霊長類やげっ歯類モデル動物では視神経乳頭部におけるRGC軸索傷害が最も早期かつ重要な病的変化であると考えられている。視神経乳頭部の部位特異的かつ細胞特異的な分子病態解明のために、１細胞レベルで解析可能な空間トランスクリプトーム解析の実施を予定している。既に解析に用いるサンプルは準備が完了している。ミクログリアが何故病的な変化を示すかについては、視神経乳頭部からの各細胞種の分離とCut&Tag法によるエピゲノム解析により理解を深めたい。また、PLX5622によってP2Y6KOマウス内のミクログリアを除去すると、視神経乳頭部において若齢アストロサイトマーカー遺伝子の発現が増加することをこれまでに見出している。ミクログリア単独の変化とそれに伴う神経傷害機構だけでなく、アストロサイトなど他の細胞への影響とそれによる病態への治療効果などを検証していく予定である。
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