生体認識と移動現象の解析に基づいた高効率クロマトグラフィープロセスの構築

• Project/Area Number: 21360382
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Properties in chemical engineering process/Transfer operation/Unit operation
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 山本 修一 Yamaguchi University, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80144921)
• Project Period (FY): 2009 – 2012
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥16,250,000 (Direct Cost: ¥12,500,000、Indirect Cost: ¥3,750,000); Fiscal Year 2011: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2010: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2009: ¥8,580,000 (Direct Cost: ¥6,600,000、Indirect Cost: ¥1,980,000)
• Keywords: クロマトグラフィー / 生体認識 / プロセス開発 / イオン交換クロマトグラフィー / モノリス / タンパク質 / DNA / PEG

Research Abstract

水溶性高分子polyethylene glycol(PEG)を結合したPEG化タンパク質は有効な医薬品であるが、そのクロマトグラフィー分離は困難でありまた分離機構もよくわかっていない。ランダムPEG化したリゾチームとモノPEG化した牛血清アルブミン(BSA)の静電気的相互作用クロマトグラフィー(IEC)における分離機構を解析した。勾配溶出実験から吸着サイト数と溶出塩濃度を求めたところ、モノPEG化したタンパク質の吸着サイト数は、ほとんど変化しないもののPEGの分子量の増加とともに溶出位置は前方にシフトした。これはタンパク質の荷電部位とクロマトグラフィーのイオン交換基がPEGの立体障害のために接近できないことが原因であると考察した。また既存の研究では単鎖PEG化リゾチームの異性体(異なるリジン残基にPEGが結合)が分離できていなかったが、モノリス型クロマトグラフィーを利用することにより3つの異性体が分離できたと結論した。
モノリスの分離性能に関して、勾配溶出からのHETP算出方法を用いて検討した。特に大きなDNAでは分配係数が勾配を緩くしても大きくならないことと、拡散物質移動がないことにより鋭い溶出曲線となることを明らかとした。HETPは0.003-0.005cm程度であり0.3cmの薄いdiskでも線速度に関わらず(すなわち高い線速度でも)60段程度の理論段数が期待できる。このことが前述のPEG化タンパク質異性体の精密分離を可能にしたと考えられる。多孔性粒子の場合は内部拡散抵抗の影響で大きなDNAについては鋭い溶出曲線を得ることは困難であった。また吸着サイト数もモノリスほど大きな値とはならなかった。

Research Products

• [Journal Article] バイオ医薬品のクロマトグラフィー分離プロセスにおけるモデルの活用 (2011)
  • Author(s): 山本修一
  • Journal Title: PharmTech Japan Volume: 27 Pages: 707-717
• [Journal Article] Interaction mechanism of mono-PEGylated proteins in electrostatic interaction chromatography (2010)
  • Author(s): M.Abe
  • Journal Title: Biotechnology Journal Volume: 5 Pages: 477-483
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Mobile phase modulator for improving the separation of proteins in electrostatic interaction chromatography (2010)
  • Author(s): S.Yamamoto
  • Organizer: 8th European Symposium on Biochemical Engineering Science
  • Place of Presentation: Palazzo della Cultura e dei Congressi Bologna Italy
  • Year and Date: 2010-09-06
• [Presentation] Peak Spreading and peak retention in Electrostatic Interaction Monolith Chromatography of Proteins and DNAs (2010)
  • Author(s): S.Yamamoto
  • Organizer: 10th International Conference on Fundamentals of Adsorption
  • Place of Presentation: 淡路夢舞台国際会議場(兵庫県)
  • Year and Date: 2010-05-24
• [Presentation] Binding and retention mechanism of proteins and DNAs in electrostatic interaction chromatography in the presence of polyethylene glycol (2010)
  • Author(s): Shuichi Yamamoto
  • Organizer: ACS 239^<th> National Meeting
  • Place of Presentation: San Francisco
  • Year and Date: 2010-03-25
• [Presentation] Optimization of stepwise elution chromatography on the basis of iso-resolution curve concept (2010)
  • Author(s): Shuichi Yamamoto
  • Organizer: ACS 239^<th> National Meeting
  • Place of Presentation: San Francisco
  • Year and Date: 2010-03-23
• [Presentation] モノリスクロマトグラフィー分離特性の推定 (2010)
  • Author(s): 西隅由樹子
  • Organizer: 化学工学会第75年会
  • Place of Presentation: 鹿児島
  • Year and Date: 2010-03-20
• [Presentation] Analysis of retention mechanism of proteins and DNAs in hydroxyapatite chromatography (2009)
  • Author(s): Shuichi Yamamoto
  • Organizer: 5th Conference on Hydroxyapatite and Related products
  • Place of Presentation: Rottach-Egern, Germany
  • Year and Date: 2009-10-12
• [Presentation] Process design of stepwise elution chromatography on the basis of iso-resolution curve (2009)
  • Author(s): Shuichi Yamamoto
  • Organizer: PREP 2009 : 22nd International Symposium, Exhibit and Workshops on Preparative/Process Chromatography
  • Place of Presentation: Philadelphia, USA
  • Year and Date: 2009-07-21
• [Presentation] Peak Spreading, Binding Site and Elution Behavior of DNA and Other Large Biomolecules in Monolithic Short-layer Ion Exchange Chromatography. (2009)
  • Author(s): Shuichi Yamamoto
  • Organizer: PREP 2009 : 22nd International Symposium, Exhibit and Workshops on Preparative/Process Chromatography
  • Place of Presentation: Philadelphia, USA
  • Year and Date: 2009-07-20