局所蛍光計測プローブによる核膜孔複合体を介した物質輸送・選別機構の1分子解析

• Project/Area Number: 21370054
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Functional biochemistry
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 吉村 成弘 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (90346106)
• Project Period (FY): 2009 – 2013
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥11,310,000 (Direct Cost: ¥8,700,000、Indirect Cost: ¥2,610,000); Fiscal Year 2011: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2010: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2009: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
• Keywords: 核-細胞質間輸送 / 核膜孔複合体 / インポーティンβ / 1分子観察 / 量子ドット / 核一細胞質間輸送

Research Abstract

本研究は、ガラスキャピラリや光ファイバを加工したプローブを用いて、"ひとつひとつの核膜孔複合体(NPC)"を対象にその輸送機能を計測するシステムを構築し、これまでの「部品」や「集団」に関する解析だけでは説明困難であった「個」のNPCにおける物質輸送の分子メカニズムに迫ることを目的とする。本年度は研究計画に従って研究を遂行し、これまでに下記の成果を得た。
・ ガラスキャピラリを加工することで先端開口100-300nmのプローブを作成し、この中に緑色蛍光タンパク質でラベルしたインポーティンβ(大腸菌で発現・精製)と、コントロールとして赤色でラベルしたグロブリンタンパク質を同時に充填した。HeLa細胞をジギトニンで処理して核膜を露出させ、マイクロマニピュレータを用いてこのキャピラリ先端を核膜上に接触させ、キャピラリ内の蛍光タンパク質が核内に移行する様子を経時的に蛍光顕微鏡で観察した。その結果、接触後1時間で核内の緑色蛍光シグナル(インポーティンβ)がコンスタントに上昇したが、赤色のシグナル(グロブリンタンパク質)は全く上昇しなかった。一方で、キャピラリを接触させていない核では、どちらの蛍光シグナルも全く増加しなかった。このことは、キャピラリ内のインポーティンβが核膜上の核膜孔複合体を通過して核内に移行したことを示すものである。
・ 長時間に及ぶ観察において、キャピラリが核膜表面からずれるという問題が頻発したため、倒立顕微鏡のステージ上にガラスキャピラリを安定に固定する特殊なホルダをデザインし、設置した。これにより、x, yおよびz方向のドリフトの軽減に成功した。

Research Products

• [Journal Article] Nup358, a nucleoporin, functions as a key determinant of the nuclear pore complex structure remodeling during skeletal myogenesis. (2011)
  • Author(s): S.H.Yoshimura, 他6名
  • Journal Title: FEBS J. Volume: 278 Pages: 610-621
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Histone and TK0471/TrmBL2 form a novel heterogeneous genome architecture in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis. (2011)
  • Author(s): S.H.Yoshimura, 他10名
  • Journal Title: Mol.Biol.Cell Volume: 22 Pages: 386-398
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Synthetic RNA-protein complex shaped like an equilateral triangle. (2011)
  • Author(s): S.H.Yoshimura, 他8名
  • Journal Title: Nat.Nanotechnol. Volume: 6 Pages: 116-121
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fluorescence labeling of carbon nanotubes and visualization of a nanotube-protein hybrid under fluorescence microscope. (2011)
  • Author(s): S.H.Yoshimura, 他4名
  • Journal Title: Biomacromolecules Volume: 12 Pages: 1200-1204
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Single-molecule anatomy by atomic force microscopy and recognition imaging. (2011)
  • Author(s): S.H.Yoshimura, 他4名
  • Journal Title: Arch.Histol.Cytol. Volume: (印刷中)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fluorescence labeling of carbon nanotubes and visualization of a nanotube-protein hybrid under (2011)
  • Author(s): S.H.Yoshimura, 他4名
  • Journal Title: Biomacromolecules Volume: 12 Pages: 1200-1204
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular Dynamics of DNA and Nucleosomes in Solution Studied by Fast-scanning Atomic Force Microscopy. (2010)
  • Author(s): S.H.Yoshimura, 他6名
  • Journal Title: Ultramicroscopy Volume: 110 Pages: 682-688
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel nucleoid protein of Escherichia coli induced under anaerobiotic growth conditions. (2010)
  • Author(s): S.H.Yoshimura, 他3名
  • Journal Title: Nuc.Acids.Res. Volume: 38 Pages: 3605-3618
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Nanobiology of cell nucleus (2010)
  • Author(s): S.H.Yoshimura
  • Organizer: SustaiN2010
  • Place of Presentation: Kyoto, Japan(招待講演)
  • Year and Date: 2010-12-12
• [Presentation] Nanobiology of cell nucleus (2010)
  • Author(s): S.H.Yoshimura
  • Organizer: SustaiN2010
  • Place of Presentation: Kyoto, Japan
  • Year and Date: 2010-12-12
• [Presentation] 核膜と核膜孔複合体の構造と進化 (2010)
  • Author(s): 吉村成弘
  • Organizer: BMB2010
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド,兵庫県(招待講演)
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] 核膜と核膜孔複合体の構造と進化 (2010)
  • Author(s): 吉村成弘
  • Organizer: BMB2010
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド, 兵庫県
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] Structural flexibility of importin b facilitates its fast and selective transport through the nuclear pore complex (2010)
  • Author(s): S.H.Yoshimura
  • Organizer: OzBio2010
  • Place of Presentation: Melbourne, Australia(招待講演)
  • Year and Date: 2010-09-28
• [Presentation] Structural flexibility of importin・facilitates its fast and selective transport through the nuclear pore complex (2010)
  • Author(s): S.H.Yoshimura
  • Organizer: OzBio2010
  • Place of Presentation: Melbourne, Australia
  • Year and Date: 2010-09-28
• [Presentation] 高大連携生命科学教育における卓越性:理科科目横断講義の実践 (2010)
  • Author(s): 吉村成弘
  • Organizer: 日本科学教育学会第34回年会
  • Place of Presentation: 広島大学(東広島キャンパス),広島県(招待講演)
  • Year and Date: 2010-09-12
• [Presentation] 高大連携生命科学教育における卓越性:理科科目横断講義の実践 (2010)
  • Author(s): 吉村成弘
  • Organizer: 日本科学教育学会第34回年会
  • Place of Presentation: 広島大学(東広島キャンパス), 広島県
  • Year and Date: 2010-09-12
• [Presentation] Solubilization and Fluorescence Labeling of Carbon Nanotubes for Biological Applications. (2010)
  • Author(s): S.H.Yoshimura
  • Organizer: 2010 AEARU research symposium
  • Place of Presentation: Tsukuba, Japan
  • Year and Date: 2010-08-31