ゲノムに存在するDNA:RNAハイブリッドの探索と機能解析

• Project/Area Number: 21657001
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Genetics/Genome dynamics
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 村上 洋太 北海道大学, 大学院・理学研究院, 教授 (20260622)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000); Fiscal Year 2010: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2009: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: DNA:RNAハイブリッド / 分裂酵母 / クロマチン

Research Abstract

分裂酵母のRNAi依存性ヘテロクロマチン形成ではヘテロクロマチン内で転写されるnon-coding RNAがRNAiの契機となる。このnon-coding RNAヒストンを標的とするRNA免疫沈降法(ヒストンRIP法)によりこのnon-coding RNAが、DNA:RNAハイブリッドを形成することが予想された。この方法は途中RNase H処理によりハイブリッドの存在を確認するなど間接的なため、in vivoで実際にハイブリッドが存在することを、ハイブリッドに特異的なモノクローナル抗体を入手し免疫蛍光染色法により検討をおこない、in vivoで実際にハイブリッドが存在することを確認したが、さらに詳細な解析によりユークロマチン領域にもハイブリッドが形成される証拠を得た。
この結果からヘテロクロマチンにかぎらずゲノムワイドにDNA:RNAハイブリッドのマッピングをおこなうことを考えた。免疫染色による検出は簡便ではあるが、ゲノム上でのハイブリッド形成の場所を特定するには不利である。またヒストンRIP法は操作が煩雑であるため、より広範かつ詳細な解析のためには、ハイブリッド検出の新規手法が必要と感じ、上記モノクローナル抗体によってハイブリッドを直接免疫沈降する方法を試みたが、抗体が免疫沈降に適さず機能しないことが判明した。そこでヒストンRIP法の改善を試み、クロマチンとともに沈降するDNAのうちハイブリッド形成しているものを抽出することに成功した。

Research Products

• [Journal Article] Dynamic regulation of heterochromatin via phosphorylation of HP1-family proteins. (2010)
  • Author(s): Shimada A.
  • Journal Title: Epigenetics 5 Pages: 30-33
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Non-coding RNA binds to heterochromatin via DNA : RNA hybrid to mediate RNAi-directed heterochromatin formation (2011)
  • Author(s): Yota Murakami
  • Organizer: International Symposium, "Physicochemical Field for Genetic Activities
  • Place of Presentation: 兵庫県・淡路市
  • Year and Date: 2011-01-25
• [Presentation] Non-coding RNA binds to heterochromatin via DNA : RNA hybrid to medi ate RNAi-directed heterochromatin formation (2010)
  • Author(s): 村上洋太
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会年会ワークショップ「DNA・RNA・タンパク質のインタープレイがおりなす遺伝情報発現」
  • Place of Presentation: 兵庫県・神戸市 招待講演
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] RNAi依存性ヘテロクロマチンにおけるnon-codingRNAの動態と機能制御 (2010)
  • Author(s): 村上洋太
  • Organizer: 日本遺伝学会大会第82回大会シンポジウム「多様な生命現象におけるエピゲノム制御」
  • Place of Presentation: 北海道、札幌市 招待講演
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] Non-coding RNA binds to heterochromatin via DNA : RNA hybrid to medi ate RNAi-directed heterochromatin formation (2010)
  • Author(s): Yota Murakami
  • Organizer: Sweden-Japan Joint Colloquium, Epigenetics
  • Place of Presentation: Stochholm, Sweden 招待講演
  • Year and Date: 2010-09-07
• [Presentation] Dynamic Regulation of Heterochrimatin (2009)
  • Author(s): 村上洋太
  • Organizer: 第24回 内藤カンファレンス"Nuclear Dynamics and RNA [II]
  • Place of Presentation: 北海道 札幌市
• [Presentation] トランスポゼース由来の分裂酵母CENP-Bホモログはキネトコアとヘテロクロマチンの境界で機能する (2009)
  • Author(s): 村上洋太
  • Organizer: 第82回日本生化学会大会 シンポジウム「トランスポゾンとの共生が織りなすゲノムシステムのダイナミクス」
  • Place of Presentation: 兵庫県 神戸市
• [Presentation] Dynamic Regulation of Heterochrimatin (2009)
  • Author(s): 村上洋太
  • Organizer: The fifth International Fission Yeast Meeting
  • Place of Presentation: 東京都
• [Presentation] Dynamic Regulation of heterochromatin sturucture/function in the cell cycle (2009)
  • Author(s): 村上洋太
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会ワークショップ「染色体倍加装置のダイナミクス」
  • Place of Presentation: 神奈川県 横浜市