プロテインキナーゼの基質分子同定法の新規開発とその有用性の検討

• Project/Area Number: 21658119
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied molecular and cellular biology
• Research Institution: Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
• Principal Investigator: 蔡 晃植 長浜バイオ大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (00263442)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000); Fiscal Year 2010: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2009: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
• Keywords: BiFC / プロテインキナーゼ / タンパク質リン酸化 / 分子間相互作用 / スクリーニング / MAPキナーゼ / 大腸菌 / カルシウム依存性プロテインキナーゼ

Research Abstract

本研究では、BiFC法を用いて特定のプロテインキナーゼの基質を網羅的に、かつ簡便に探索する方法を構築しその有用性を検証することを目的とする。最終年度の研究では、プロテインキナーゼとその基質として知られている、イネのOsMEK1とOsMAPKのC末端側にそれぞれVenusのN末端半分とC末端半分を融合したタンパク質を植物内で発現するベクターを作成し、これを同時にイネのプロトプラストに導入したところ、相互作用が確認された。そこで、新たに大腸菌で発現するベクターを作成して同じように両ベクターを大腸菌DH5α株に導入したが、BiFCによる蛍光は認められなかった。これは、大腸菌DH5α株では発現したタンパク質が正確な立体構造をとっていない可能性を考え、真核生物のタンパク質と同じ立体構造をとりやすい大腸菌株に変えて実験を行った。その結果、OsMEK1とOsMAPKの特異的な相互作用を確認することが出来、当初目的とした簡便な探索系を構築することに成功した。そこで次に、構築した検定系を用いて植物免疫の情報伝達に関与することが明らかになっているOsCPK12と相互作用する基質タンパク質のスクリーニングを行った。まず、VenusのC末端半分と融合した形で発現する植物のcDNAライブラリーを構築し、このライブラリーを用いてスクリーニングを行った。12,000クローンについてスクリーニングを行ったところ、Dynamin、CaM binding protein、Fts A等を含む319クローンを選抜することが出来た。詳細な機能ドメイン検索を行ったところ、OsCPK12は細胞周期に関わるドメインと相互作用することが新たに明らかになり、本研究で構築したスクリーニング系がプロテインキナーゼの基質を選抜し、その機能を研究する上で非常に有用であることが実証された。

Research Products

• [Journal Article] Characterization of receptor proteins using affinity cross-linking with biotinylated ligands. (2010)
  • Author(s): Shinya, T., Osada, T., Desaki, Y., Hatamoto, M., Yamanaka, Y., Hirano, H., Takai, R., Che, F.S., Kaku, H., Shibuya, N.
  • Journal Title: Plant Cell Physiol. Volume: 51 Pages: 262-270
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The transcription factor OsNAC4 is a key positive regulator of plant hypersensitive cell death. (2009)
  • Author(s): Kaneda, T., Taga, Y., Takai, R., Iwano, M., Matsui, H., Takayama, S., Isogai, A., Che F.S.
  • Journal Title: EMBO J. 28 Pages: 926-936
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phosphocholine-containing glycosyl inositol-phosphoceramides from Trichoderma viride induce defense responses in cultured rice cells. (2009)
  • Author(s): Uchiyama, R., Aoki, K., Sugimoto, H., Taka, N., Katayama, T., Itonori, S., Sugita, M., Che, F.S., Kumagai, H., Yamamoto, K.
  • Journal Title: Biosci.Biotechnol.Biochem. 73 Pages: 74-78
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Role of OsHSP90 and IREN, Ca^<2+> dependent nuclease, in plant hypersensitive cell death induced by transcription factor OsNAC4. (2009)
  • Author(s): Taga, Y., Takai, R., Kaneda, T., Matsui, H., Isogai, A., Che, F.S.
  • Journal Title: Plant Signaling & Behavior 4 Pages: 1-3
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Coordination of plastid protein import and nuclear gene expression by plastid-to-nucleus retrograde signaling. (2009)
  • Author(s): Kakizaki, T., Matsumura, H., Nakayama, K., Che F.S., Terauchi, R., Inaba, T.
  • Journal Title: Plant Physiol. 151 Pages: 1339-1353
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 過敏感細胞死誘導に関与する植物病原細菌Acidovorax avenaeの非病原性菌株由来のエフェクタータンパク質の同定と機能解析 (2011)
  • Author(s): 近藤真千子、乗京知宏、吉田裕貴、宇野雄太、島田真弥、蔡晃植
  • Organizer: 2011年度 日本農芸化学学会
  • Place of Presentation: 京都、京都女子大(学会中止、発表成立)
  • Year and Date: 2011-03-27
• [Presentation] 鞭毛タンパク質フラジェリンのイネ受容体の同定と認識機構解析 (2011)
  • Author(s): 桂木雄也、柁山航介、田中佑佳、高井亮太、蔡晃植
  • Organizer: 第52回 日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 仙台、東北大学(学会中止、発表成立)
  • Year and Date: 2011-03-20
• [Presentation] 植物病原細菌が生産するエフェクタータンパク質による植物の過敏感細胞死誘導の機構解析 (2011)
  • Author(s): 近藤真千子、乗京知宏、吉田裕貴、宇野雄太、島田真弥、蔡晃植
  • Organizer: 第52回 日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 仙台、東北大学(学会中止、発表成立)
  • Year and Date: 2011-03-20
• [Presentation] Acidovorax avenaeのフラジェリンに存在する糖鎖構造とイネの免疫反応誘導への関与 (2011)
  • Author(s): 平井洋行、古川岳人、蔡晃植
  • Organizer: 2011年度 日本農芸化学学会
  • Place of Presentation: 京都、京都女子大(学会中止、発表成立)
  • Year and Date: 2011-03-20
• [Presentation] イネ免疫反応誘導時における細胞内Ca^<2+>変化と免疫誘導へのOsCPKの関与 (2010)
  • Author(s): 神村麻友、藤原沙都姫、笹木亮志、濱本訓行、磯貝彰、高山誠司、蔡晃植
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸、ポートアイランド
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] 植物病原細菌の鞭毛タンパク質フラジェリンのイネにおける特異的認識に関与する受容体の同定とその認識機構解析 (2010)
  • Author(s): 柁山航介, 桂木雄也, 田中佑佳, 高井亮太, 蔡晃植
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸、ポートアイランド
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] 植物の過敏感細胞死に伴う核DNA断片化の誘導機構の解明 (2010)
  • Author(s): 日比野孝紀、多賀有里、大坪由佳、蔡晃植
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸、ポートアイランド
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] 植物病原細菌に存在する植物免疫誘導タンパク質のプロテオームを用いた同定とその機能解析 (2010)
  • Author(s): 近藤真千子, 乗京知宏, 吉田裕貴, 宇野雄太, 島田真弥、蔡晃植
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸、ポートアイランド
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] 植物病原細菌Acidovorax avenaeを認識したタバコ(Nicotiana benthamiana)において認められる植物免疫反応誘導機構の解析 (2010)
  • Author(s): 宇野雄太, 乗京知宏, 近藤真千子, 吉田裕貴, 島田真弥, 蔡晃植
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸、ポートアイランド
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] 物病原細菌の鞭毛タンパク質フラジェリンのイネにおける特異的認識に関与する受容体の同定とその認識機構解析 (2010)
  • Author(s): 柁山航介, 桂木雄也, 田中佑佳, 高井亮太, 蔡晃植
  • Organizer: 第45回 植物化学調節学会
  • Place of Presentation: 兵庫、神戸大学
  • Year and Date: 2010-11-02
• [Presentation] イネ免疫反応誘導時における細胞内Ca^<2+>変化免疫誘導へのOsCPKの関与 (2010)
  • Author(s): 神村麻友、藤原沙都姫、笹木亮志、濱本訓行、磯貝彰、高山誠司、蔡晃植
  • Organizer: 第45回 植物化学調節学会
  • Place of Presentation: 兵庫、神戸大学
  • Year and Date: 2010-11-02
• [Presentation] イネの病原菌認識時に誘導される活性酸素発生のCa2+依存性プロテインキナーゼによる制御機構解析 (2010)
  • Author(s): 神村麻友、上坂有矢、笹木亮志、濱本訓行、蔡晃植
  • Organizer: 日本農芸化学会 関西支部大会
  • Place of Presentation: 奈良、近畿大学農学部
  • Year and Date: 2010-10-02
• [Presentation] 転写因子OsNAC4による過敏感細胞死誘導の機構解析 (2010)
  • Author(s): 大坪由佳、日比野孝紀、松井弘善、多賀有里、蔡晃植
  • Organizer: 日本農芸化学会 関西支部大会
  • Place of Presentation: 奈良、近畿大学農学部
  • Year and Date: 2010-10-02
• [Presentation] 植物の過敏感細胞死に伴う核DNA断片化の誘導機構の解明 (2010)
  • Author(s): 日比野孝紀、多賀有里、大坪由佳、蔡晃植
  • Organizer: 日本農芸化学会 関西支部大会
  • Place of Presentation: 奈良、近畿大学農学部
  • Year and Date: 2010-10-02
• [Presentation] イネ免疫反応誘導時における細胞内Ca^<2+>変化と免疫誘導へのOsCPKの関与 (2010)
  • Author(s): 桂木雄也, 柁山航介, 田中佑佳, 高井亮太, 蔡晃植
  • Organizer: 日本農芸化学会 関西支部大会
  • Place of Presentation: 奈良、近畿大学農学部
  • Year and Date: 2010-10-02
• [Presentation] HEFL照明を用いた植物工場におけるアイスプラントの生育と高機能化 (2010)
  • Author(s): 早川真、辻昭久、蔡晃植
  • Organizer: 本生物環境工学会 2010年大会
  • Place of Presentation: 京都、京都大学
  • Year and Date: 2010-09-09
• [Presentation] Identification of novel bacterial effector proteins from pathogenic bacteria involved in induction of rice immune responses (2010)
  • Author(s): Machiko Kondo, Tomohiro Norikyo, Yuki Yosida, Yuta Uno, Fang-Sik Che
  • Organizer: Global COE Summer Camp 2010
  • Place of Presentation: 兵庫県、淡路夢舞台国際会議場
  • Year and Date: 2010-08-27
• [Presentation] Specific induction mechanism of plant immune responses by flagellin from Acidovorax avenae (2010)
  • Author(s): Hiroyuki Hirai, Takehito Hurukawa, Akira Isogai, Fang-Sik Che
  • Organizer: Global COE Summer Camp 2010
  • Place of Presentation: 兵庫県、淡路夢舞台国際会議場
  • Year and Date: 2010-08-27
• [Presentation] 植物病因細菌Acidovorax avenae非病原性菌株のイネ免疫反応を誘導するエフェクタータンパク質の同定と機能解析 (2010)
  • Author(s): 近藤真千子, 乗京知宏, 宮田千加、蔡晃植
  • Organizer: 2010年度日本農芸化学会年回
  • Place of Presentation: 東京、東京大学
  • Year and Date: 2010-03-29
• [Presentation] 植物病原細菌Acidovorax avenaeのフラジェリンに存在する糖鎖のイネ免疫誘導特異性における役割 (2010)
  • Author(s): 平井洋行, 古川岳人, 磯貝彰, 蔡晃植
  • Organizer: 2010年度日本農芸化学会年回
  • Place of Presentation: 東京、東京大学
  • Year and Date: 2010-03-29
• [Presentation] 転写因子OsNAC4によって誘導される過敏感細胞死の機構解析 (2010)
  • Author(s): 大坪由佳、松井弘善、多賀有里、日比野孝紀、金田隆志、磯貝彰、蔡晃植
  • Organizer: 第51回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 熊本、熊本大学
  • Year and Date: 2010-03-20
• [Presentation] イネ免疫反応誘導時における細胞内Ca^<2+>の変化と免疫誘導へのOsCPKの関与 (2010)
  • Author(s): 神村麻友、藤原沙都姫、笹木亮志、濱本訓行、磯貝彰、高山誠司、蔡晃植
  • Organizer: 第51回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 熊本、熊本大学
  • Year and Date: 2010-03-20
• [Presentation] イネ免疫反応誘導に関与する植物病原細菌由来の新規エフェクタータンパク質の同定とその機能解析 (2009)
  • Author(s): 近藤真千子, 乗京知宏, 吉田裕貴, 察晃植
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜、パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2009-12-10
• [Presentation] 植物病原細菌Acidovorax avenaeの鞭毛タンパク質フラジュリンに存在する糖鎖修飾と植物免疫誘導特異性への関与 (2009)
  • Author(s): 平井洋行, 古川岳人, 大坪由佳, 磯貝彰, 蔡晃植
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜、パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2009-12-10
• [Presentation] 植物における病原細菌の鞭毛タンパク質フラジェリンの認識とその認識情報による免疫反応の誘導機構 (2009)
  • Author(s): 察晃植
  • Organizer: 自然免疫における普遍性と多様性
  • Place of Presentation: 東京、明治大学
  • Year and Date: 2009-09-14
• [Presentation] Induction mechanism of rice immune responses mediated by Hrp gene cluster of Acidovorax avenae (2009)
  • Author(s): Machiko Kondo, Tomohiro Norikyo, Fang-Sik Che
  • Organizer: The 4th Joint seminner of Marine Bio NURI Center, Pukyong National University and Pusan National University and Nagahama Institute of Bio-Science and Technology.
  • Place of Presentation: Busan, Republic of Korea
  • Year and Date: 2009-04-24
• [Presentation] Glycosylation of flagellin from Acidovorax avenae is involved in specific recogtnition by rice (2009)
  • Author(s): Takehito Furukawa, Hiroyuki Hirai, Rie Hashida, Fang-Sik che
  • Organizer: The 4th Joint seminner of Marine Bio NURI Center, Pukyong National University and Pusan National University and Nagahama Institute of Bio-Science and Technology.
  • Place of Presentation: Busan, Republic of Korea
  • Year and Date: 2009-04-24
• [Presentation] Cellular Ca2+ dynamics and role of OsCPKs in rice immune responses (2009)
  • Author(s): Mayu Kamimura, Ryoji Sasaki, Kuniyuki Hamamoto, Fang-Sik Che
  • Organizer: The 4th Joint seminner of Marine Bio NURI Center, Pukyong National University and Pusan National University and Nagahama Institute of Bio-Science and Technology.
  • Place of Presentation: Busan, Republic of Korea
  • Year and Date: 2009-04-24
• [Presentation] Plant Hypersensitive cell death mediated by transcription factor OsNAC4 (2009)
  • Author(s): Fang-Sik Che, Yuri Taga, Hiroyoshi Matsui, Takashi Kaneda
  • Organizer: The 4th Joint seminner of Marine Bio NURI Center, Pukyong National University and Pusan National University and Nagahama Institute of Bio-Science and Technology.
  • Place of Presentation: Busan, Republic of Korea
  • Year and Date: 2009-04-24
• [Book] 植物のジグナル伝達 (2010)
  • Author(s): 蔡晃植
  • Total Pages: 238
  • Publisher: 共立出版