細胞表面アンドロゲン結合蛋白の単離

• Project/Area Number: 21659103
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Experimental pathology
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 田中 亨 自治医科大学, 医学部, 教授 (80264406)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000); Fiscal Year 2010: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2009: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
• Keywords: 蛋白質 / 病理学 / 性ホルモン

Research Abstract

昨年度に引き続き蛋白精製を行った。FITCラベルBSA架橋testosterone(FITC-T-BSA)をアンドロゲン反応性マウス乳癌細胞株SC-3に室温で5分間作用させ、ホルマリンにて架橋後に細胞質、細胞膜を回収した。このサンプルをFITC抗体で免疫沈降し2次元電気泳動で展開したが、1次元泳動と比べて確認できるスポットが著しく減少した。スタンダードマーカーは所定の位置に泳動されており、ゲルへの展開は良好と考えられるが、原因は不明である。一方、DSS処理による架橋も試みたが同様の結果であった。さらに、FITCラベルを行わずに、T-BSAにより細胞を処理し、BSA抗体で免疫沈降する方法も行ったが有意なバンドは検出できなかった。
一方、アンドロゲン刺激で早期に誘導されるシグナルの検討では、レポーター活性の解析により新たに、NFAT経路が活性化されることを見出した。10週齢オス、メスマウスでは心でのNFATc1発現がオスで亢進しており、アンドロゲンが細胞膜からのシグナルを介して、NFAT活性を調節している可能性が考えられる。心筋などを用いて、結合蛋白が精製できないか、さらに、検討する予定である。
総括としては、2次元電気泳動での分離向上に期待して、生きた細胞にアンドロゲン刺激を行う手法で精製を試みたが、結果的には、良好な精製過程を示すことはできなかった。ただ、早期に多彩なシグナルが活性化することは示すことができ、今後、精製材料や精製方法を改善して、さらに、研究を進める予定である。