| Project/Area Number |
21659242
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Hematology
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| Research Institution | Ohu University |
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Principal Investigator |
山本 正雅 奥羽大学, 薬学部, 准教授 (50150884)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
嶋 緑倫 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30162663)
志村 紀子 奥羽大学, 薬学部, 講師 (60287480)
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| Project Period (FY) |
2009 – 2010
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2010)
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| Budget Amount *help |
¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000)
Fiscal Year 2010: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2009: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
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| Keywords | ヒト杭体 / SPYMEG / 血友病A / インヒビター / イディオタイプ抗体 / 細胞融合 / 電気的細胞融 / 抗体産生細 / ヒト抗体 / インヒビタ |
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| Research Abstract |
【目的】ヒト末梢単核球をSPYMEG細胞とPEG法で融合しヒト抗体産生ハイブリドーマを作製する方法によりヒトインフルエンザウイルスに対する抗体作製が可能であることを示してきた(BBRC387(2009)180-185)。本法を用いて、血友病A患者に発生したインヒビター抗体の作製を目的とした。【結果】細胞融合には化学的なPEG法を用いた。コロニー形成率は10～30%と低かった。ハイブリドーマ培養上清の抗体をELISA法によりスクリーニングしたがインヒビター陽性ウェルは確認できなかった。感染症患者から抗インフルエンザウイルス抗体を作製したようにはインヒビター抗体が得られなかったことから、改善が必要と考え、(1)血中抗体の力価の差、(2)融合効率の改善、(3)抗体産生細胞の濃縮に関し検討した。(1)は高力価の患者を利用することで対応可能とした。(2)の対応は、電気的融合法を検討した。電気的手法は細胞への傷害が少なく、PEG法より高効率で抗体作製ができるとされる。SPYMEGでは電圧を400V以上にすることにより融合効率をPEGと同程度(100%融合率)に高めることに成功した。しかし本条件下では抗体産生率がPEG法に比べ約1/2と著しく低くPEG法を踏襲した。次に(3)であるが、血友病A患者からの融合成績では、融合初期に陽性クローンが確認できたが、培養途中で産生能を失うことが主な原因であった。そこで、抗原をコーティングした磁気ビーズを用い、抗体産生細胞を選択する方法を検討し、細胞を特異的に好成績であった。【考察】電気融合法はPEG法を超えなかったので、PEG法にて血友病A患者からのインヒビターの作製を試みたが、最終的に陽性クローンは得られなかった。今後、さらなる改善策として、磁気ビーズによる細胞の濃縮と、ウアバインなどによる遺伝子の脱落を抑えるなどの処理を行い、抗体産生を安定化させ、高力価のインヒビター陽性患者からの末梢単核球を調製し例数を多く試みる必要がある。
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