RNA干渉を用いた血管内皮細胞インターロイキン発現抑制による敗血症組織傷害の緩和

Research Project

Project/Area Number	21659365
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Anesthesiology/Resuscitation studies
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	荒井俊之京都大学, 医学研究科, 准教授 (80175950)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山下浩平京都大学, 医学研究科, 助教 (80402858)
Project Period (FY)	2009 – 2010
Project Status	Completed (Fiscal Year 2010)
Budget Amount *help	¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000) Fiscal Year 2010: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000) Fiscal Year 2009: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Keywords	血管内皮細胞 / LPS / インターロイキン8 / 活性酸素 / siRNA / NADPHオキシダーゼ-1 / 播種性血管内凝固症候 / 組織因子 / 遺伝子導入 / MTTアッセイ / リアルタイムPC / ゲル電気泳動 / ELISA
Research Abstract	本年度は、正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)を用いて、敗血症病態形成におけるNADPHオキシダーゼ-1(Nox1)の役割を検討した。先ずLPS刺激によりHUVECがIL-8ならびに活性酸素(ROS)を産生することを確認した。次にIL-8刺激によりHUVECがROSを産生すること、IL-8誘導ROS産生はLPS誘導ROS産生(2時間以上)に比べ、短時間(1時間以内)であること、IL-8受容体(CXCR1, 2)の中和抗体やIL-8特異的siRNAの前処理によりLPS誘導ROS庫生が部分的に抑制されることを明らかにした。これらの所見から、HUVECにおいて、LPS刺激によるROS産生はIL-8を介することが示唆され,た。また、LPSおよびIL-8誘導ROS産生はNox阻害剤であるDPIの前処理により完全に抑制されることから、両者ともにNox依存性であることが明らかとなった。現在までにNoxは5種類のアイソザイムが知られており(Nox1-5)、HUVECにおけるNoxファミリーのmRNA発現を検討したところ、Nox2, 4は恒常的に発見し、Nox1はLPSやIL-8刺激により誘導されることが明らかとなった。誘導型NoxであるNox1の生体内の役割は不詳な点が多く、敗血症病態への関与は明らかでなかったため、Nox1に焦点を当てて検討を行った。その結果、Nox1特異的siRNAでHUVECを処理したところ、LPS誘導ROS産生は有意に抑制された。敗血症において、播種性血管内凝固症候群(DIC)は重要な合併症の一つであり、DICの発症には凝固カスケードの最上流に位置する組織因子(tissue factor, TF)の発現が重要な役割を果たす。TF発現はLPS刺激により誘導されるが、ROS消去剤であるNACの前処理によりLPS誘導TFの発現が抑制され、TF発現におけるROSの関与を示した。また、IL-8およびNox1各々の特異的siRNAをHUVECに導入したところ、LPS誘導TF発現が抑制された。以上の所見から、HUVECにおいて、LPS刺激は先ずIL-8産生を誘導し、次いでNox1発現を介してROSを産生し、さらにROSはTFの発現を誘導することが明らかとなった。