| Project/Area Number |
21659408
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Plastic surgery
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
宮崎 数史 浜松医科大学, 医学部, リサーチアシスタント (10537418)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大野 浩司 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (90263277)
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| Project Period (FY) |
2009 – 2010
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2010)
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| Budget Amount *help |
¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
Fiscal Year 2010: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2009: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
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| Keywords | 外科 / 神経科学 / 移植・再生医療 |
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| Research Abstract |
CLP36結合蛋白同定
野生型PC12細胞の1% Triton lysis bufferでホモジナイズし、可溶化蛋白の中からCLP36複合体を抗CLP36抗体(BD biosciences)-Dynabeads Protein G (Invitrogen)を用いて免疫沈降させた。この抗体が免疫沈降に使用できることは、すでに確認済みである(Tamura et al., BBRC 364:589-94, 2007)。沈降した蛋白群を0.5M NH_4OH, 0.5mM EDTAで溶出、SDS-PAGEによって分離・展開し、銀染色によってバンドとして可視化した。同時にコントロールとして、1)野生型PC12細胞に対しnormal IgGを使った免疫沈降、2)CLP36ノックダウンPC12細胞に対し抗CLP36抗体を使った免疫沈降、を施行し、これらの沈降産物との比較を行うことでCLP36複合体として現れている特異的なバンドを選び出した。
CLP36結合蛋白と見做されたバンドを、銀染色したゲルから1mmのブロックとして切り出し、還元化、アルキル化した後、トリプシン(Promega)によるゲル内消化を加えた。得られたペプチドをゲルから抽出し、LC-MS/MSによるペプチド酸配列の同定を行った。その結果をもとに検索エンジンを使い、蛋白の本体を明らかにした。本成果を主に、Neuroscience Letters誌(2010)において発表した。
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