ボトムアップ的ライブラリー構築による抗体様RNA分解酵素の創製

• Project/Area Number: 21710236
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Living organism molecular science
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 中西 猛 大阪市立大学, 大学院・工学研究科, 講師 (20422074)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2010: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2009: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
• Keywords: RNA分解酵素 / 抗体 / タンパク質工学 / ペプチド移植 / ファージディスプレイ / 受容体 / 人工結合タンパク質 / 分子認識

Research Abstract

本研究では、ヒト由来のRNA分解酵素に対して機能性人工ペプチドを導入することによって、本来の基質であるRNAとは異なる標的分子認識能を新たに付与した人工酵素の調製系を確立することを目指している。本年度の研究成果は以下の通りである。
1.人工ペプチド挿入RNA分解酵素の調製系の最適化前年度に巻き戻し操作によって、不溶性画分から調製した人工ペプチド挿入RNA分解酵素は酵素活性を示したが、巻き戻し操作後の試料には多種の分子種が混在していた。そこで巻き戻し操作の更なる検討を行った結果、非還元状態での電気泳動において、ほぼ単一バンドを与える条件を見出すことができた。
2.人工ペプチド挿入RNA分解酵素の機能評価tRNAを用いてRNA分解活性を評価した結果、人工ペプチド挿入RNA分解酵素は活性を示す一方で、コントロール酵素と比較して若干、低い活性であったことから、外来ペプチド挿入に伴う足場タンパク質への影響が見られた。フローサイトメトリーにより標的抗原発現細胞に対する結合活性を評価した結果、有意な結合を確認できなかったことから、人工ペプチド挿入箇所の最適化、機能性向上が重要であることがわかった。
3.変異導入RNA分解酵素の作製RNA分解酵素の安定な分泌発現を目的として、宿主に対する細胞毒性を軽減するために、酵素活性部位に存在するアミノ酸残基に対して変異導入を行った。その結果、変異体は可溶性タンパク質として分泌可能であったことから、RNA分解酵素の安定なファージ提示系構築に向けて前進した。

Research Products

• [Journal Article] Integration of PEGylation and refolding for renaturation of recombinant proteins from insoluble aggregates produced in bacteria-Application to a single-chain Fv fragment (2010)
  • Author(s): Izumi Kumagai
  • Journal Title: Journal of Bioscience and Bioengineering Volume: 109 Pages: 447-452
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Protein-protein interactions and selection : generation of molecule-binding proteins on the basis of tertiary structural information (2010)
  • Author(s): Mitsuo Umetsu
  • Journal Title: FEBS Journal Volume: 277 Pages: 2006-2014
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The effects of disappearance of one charge on ultrafast fluorescence dynamics of FMN binding protein (2010)
  • Author(s): Haik Chosrowjan
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry B Volume: 114 Pages: 6175-6182
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Highly enhanced cytotoxicity of a dimeric bispecific diabody, the hEx3 tetrabody (2010)
  • Author(s): Ryutaro Asano
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry Volume: 285 Pages: 20844-20849
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Application of the Fc fusion format to generate tag-free bispecific diabodies (2010)
  • Author(s): Ryutaro Asano
  • Journal Title: FEBS Journal Volume: 277 Pages: 477-487
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Direct and selective immobilization of proteins by means of an inorganic material-binding peptide : Discussion on functionalization in the elongation to material-binding peptide (2010)
  • Author(s): Nozomi Yokoo
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry B Volume: 114 Pages: 480-486
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Contribution of asparagine residues to the stabilization of a proteinaceous antigen-antibody complex, HyHEL-10-hen egg white lysozyme (2010)
  • Author(s): Akiko Yokota
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry Volume: 285 Pages: 7686-7696
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] High-affinity anti-inorganic-material antibody generation by integrating graft and evolution technologies : The potential of antibodies as biointerface molecules (2010)
  • Author(s): Takamitsu Hattori
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry Volume: 285 Pages: 7784-7793
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biotinylated bionanocapsules for displaying diverse ligands toward cell specific delivery (2009)
  • Author(s): Takuya Shishido
  • Journal Title: Journal of Biochemistry Volume: 146 Pages: 867-874
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ヘテロ会合性ペプチドを利用した2機能性多量体化抗体の創製 (2010)
  • Author(s): 藤澤真吾
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会年会・第83回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2010-12-07
• [Presentation] 超高速時間分解蛍光法を用いたFMN結合タンパク質における電子移動反応の解析 (2009)
  • Author(s): 中西猛
  • Organizer: 第9回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 熊本全日空ホテルニュースカイ
  • Year and Date: 2009-05-22
• [Presentation] 会合ペプチドユニットによる低分子抗体アセンブリ技術とその応用 (2009)
  • Author(s): 梅津光央
  • Organizer: 第9回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 熊本全日空ホテルニュースカイ
  • Year and Date: 2009-05-22
• [Remarks]
  • URL: http://www.bioa.eng.osaka-cu.ac.jp/bic/